[发明专利]一种提取抗氧化性多肽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及天然抗氧化剂的提取方法，尤其涉及以发酵肉制品为原料提取抗氧化性多肽的方法及其鉴定方法。

背景技术

近年来随着对天然抗氧化剂的研究深入，从植物、动物、微生物等原料中酶法降解、分离提取抗氧化多肽的报道也逐渐增多。与人工合成的抗氧化剂如BHT、BHA等相比，这些非人工合成的多肽具有分子量小、结构简单、活性强、易于吸收及无毒害等优点。目前，从植物中提取抗氧化肽的研究多见于大豆、豌豆、大米等原料中；从动物、微生物中提取抗氧化肽的研究多见于奶、鱼、肉、微生物发酵液等原料中。

目前，从动植物体提取多肽主要用酶解法，酶解控制困难，容易使多肽分裂降解,形成小分子肽，降低了抗氧化效果。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于避免多肽提取时降解，保持高抗氧化活性，提高提取精准度。

为解决上述问题，本发明提供一种发酵肉制品中抗氧化活性多肽的提取方法，具体提取步骤：

取发酵肉制品的瘦肉，去除其中的肌腱和肌膜，切碎斩匀为细碎颗粒状肉粒，称量1份所述肉粒，投入到浸提液中，匀浆后得匀浆液；

将所述匀浆液静置后进行第一次离心处理，然后过滤，得澄清上清液，往上清液中加入沉淀液，静置后进行第二次离心处理，得到二次上清液；

将所述二次上清液过滤，旋转蒸发器浓缩，经冷冻干燥后得粗肽粉；

对所述粗肽粉进行分离纯化，制得粉末态抗氧化活性肽。

所述步骤1）中匀浆条件为：20000-24000r/min^-，匀浆2-5次，每次8-15s，中间间歇8-15s。

所述步骤1）中浸提液为磷酸盐缓冲液或盐酸溶液，磷酸盐缓冲液浓度为0.02mol/L^-，盐酸溶液浓度为0.01 mol/L；所述浸提液的体积量为肉粒的3-4倍。

所述步骤2）中第一次离心处理条件为：所述匀浆液在4℃环境中静置15-25分钟后保持4℃离心，所述第二次离心处理条件为：静置时间为10-15小时。

所述步骤2）中沉淀液为乙醇溶液或三氟乙酸溶液，乙醇溶液浓度为40%，三氟乙酸溶液浓度为0.1%，所述沉淀液的体积量为上清液的3-4倍。

所述步骤3）中过滤采用0.45 μm滤膜过滤。

所述步骤4）中分离纯化依次采用凝胶层析法、阴离子交换柱层析法和反相高效液相色谱法。

所述凝胶层析法用超纯水平衡凝胶层析柱，填料为葡聚糖凝胶树脂SephadexG-25，上样量为2mL,洗脱速度为2mL/min,检测波长为280nm。

所述阴离子交换柱层析用磷酸盐缓冲液平衡层析柱，所述磷酸盐缓冲液浓度为0.02mol/L，pH值为8.0，填料为阴离子交换树脂，上样量为5 mL，以A液：磷酸盐缓冲液,B液：NaCl-磷酸盐缓冲液洗脱，所述NaCl-磷酸盐缓冲液浓度为1 mol/mL，洗脱速度为2 mL/min，检测波长为280nm ，0-100%B梯度洗脱。

所述反相高效液相色谱法用A：乙腈和B：甲酸0.1%作为洗脱液，流速0.3 mL/min，上样量为 0.5mL，检测波长为280nm。

  本发明的有益效果是：本发明操作简便，避免了采用酶解方法提取时多肽的降解，提取率高，所得的抗氧化多肽活性强，是一种可操作性强，应用价值高的天然抗氧化剂的提取方法；本发明也为肉制品中活性多肽的基础研究及相关产品的开发应用提供了依据。

附图说明

图1 G-25凝胶层析对粗肽纯化的效果，

图2 不同峰段多肽对自由基的清除效果，

图3 阴离子交换柱层析对C片段多肽的分离效果，

图4 阴离子交换柱所得不同峰段多肽对自由基的清除效果，

图5 RP-HPLC 对C5片段多肽的分离效果。

具体实施方式

抗氧化多肽的制备方法如下：

1、粗肽的提取

粗肽的提取工艺为：

取发酵肉制品的瘦肉，去除其中的肌腱和肌膜，切碎斩匀为细碎颗粒状肉粒，称量1份所述肉粒，投入3-4倍体积量的浸提液中，20000-24000 r/min-，匀浆2-5次，每次8-15 s，中间间歇8-15 s，得匀浆液；将匀浆液在4℃环境中静置15-25分钟后进行第一次离心处理，然后过滤，得澄清上清液，往上清液中加入3-4倍体积量的沉淀液，静置10-15小时后进行第二次离心处理，然后上清液采用0.45 μm滤膜过滤，旋转蒸发器浓缩，经冷冻干燥后得粗肽粉。