[发明专利]一种诱导制备胸苷磷酸化酶的方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种诱导制备胸苷磷酸化酶的方法及应用。

背景技术

胸苷磷酸化酶(TPase)广泛存在于原核以及真核生物的细胞中。TPase可特异性作用于β-胸苷(β-TR)，催化β-TR可逆磷酸化反应，由β-TR生成脱氧核糖-1-磷酸以及胸腺嘧啶(T)，亦可由脱氧核糖-1-磷酸和T生成β-TR(①)若与其他核苷磷酸化酶共同作用，可生成一系列其他核苷和磷酸基团(Pi)(②)：

①

②

近年来核苷类化合物在抗病毒、抗肿瘤方面的作用越来越引起人们的关注。故而上述反应生产的新核苷对于新药研发及改进化学合成工艺具有重要意义。现今报道的核苷类药物很多，例如治疗艾滋病的HIV逆转录酶抑制剂齐夫多定(AZT)、双脱氧肌苷(ddI)、扎西他滨(ddC)等都有望通过上法制备。

TPase广泛存在于各种微生物中，目前TPase一般通过发酵培养基的改良、原生质体融合、基因工程构建等技术提高酶的表达(1.王伟洁等，产胸苷磷酸化酶短乳杆菌融合菌株的构建及其特性，食品与发酵工业，2013年39卷第8期，21-25页；2.王伟洁等，短乳杆菌产胸苷磷酸化酶发酵培养基的优化，化工进展，2013年32卷第5期，1116-1121页)，这些方法步骤复杂，成本较高。

发明内容

本发明公开了一种通过底物诱导提高TPase的表达的方法。

本发明以乙酰短杆菌(Brevibacterium acetylicum)和大肠杆菌(Escherichia.coli)为TPase的酶源，以近似底物嘧啶类核苷为诱导物提高酶的表达，结果发现胸苷类嘧啶核苷能使TPase的酶活性得到显著提高。

本发明以嘧啶类核苷为诱导物，并以诱导之后TPase活性的高低来衡量其表达状况，所使用的诱导物分别为：β-胸苷(Thymidine,β-TR)、双脱氧胸苷(Dideoxythymidine,d4T)、尿苷(Uridine,UR)、5-甲基尿苷(5-Methyluridine,5-MUR)、5’-脱氧氟尿苷(Doxifluridine，5-DFUR)、2’-脱氧胞苷(2’-Deoxycytidine,2’-dCR)。通过筛选，β-胸苷(Thymidine,β-TR)、双脱氧胸苷(Dideoxythymidine,d4T)的诱导效果最佳，并具有制备2'-脱氧腺苷(2'-dAR)、阿糖腺苷(Ara-A)和2'-脱氧氟尿苷(2'-DFUR)的应用价值。

具体方法如下：以β-TR、d4T、UR、5-MUR、5-DFUR、2'-dCR对乙酰短杆菌的TPase进行诱导，即将乙酰短杆菌分别接入未加诱导物的固体培养基和分别含有20mmol/Lβ-TR或d4T、UR、5-MUR、5-DFUR、2'-dCR的固体诱导培养基中，32℃培养24h，然后分别接入含有100ml液体培养基的500ml摇瓶中，36℃，150-250rpm，培养20-28h，离心后获得菌体用pH7.0、30mmol/L磷酸缓冲液洗涤2遍，再离心将菌体作为TPase置于-30℃冰柜中保存备用。将不同诱导物获得的TPase分别测定活性，结果如表1：

表1未经诱导与经β-TR、d4T、UR、5-MUR、5-DFUR、2'-dCR诱导后制备的乙酰短杆菌TPase活性