[发明专利]一种安全编码Cas9蛋白的核酸分子及其表达载体

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种安全编码Cas9蛋白的核酸分子及其表达载体。

背景技术

CRISPR-Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat(CRISPR)-CRISPR-associated endonuclease(Cas9))技术是近年出现的革命性的基因编辑技术。该技术可以快速，容易的实现对目标DNA序列在精确的位点进行编辑，包括突变，修改，插入等改变，使得生命的遗传密码可以按照人类的意愿改变，可以在细胞层面，也可以在生命个体层面。该技术还近年还有广泛的拓展应用，如用于基因的激活，干扰，活细胞基因标记，RNA的切割等等。对于农业，工业，药业，以及人类的健康都有广泛的应用前景(参见文献:Hsu,P.D.,Lander,E.S.,and Zhang,F.(2014).Development and Applications of CRISPR-Cas9for Genome Engineering.Cell 157,1262-1278)。

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)即成簇规律间隔短回文重复，是存在于细菌基因组中的DNA序列，Cas(CRISPR associated)即CRISPR相关基因，有多种类型，Cas9是其中一种。CRISPR-Cas9系统本身是细菌的一种获得性免疫机制，用于切割入侵的外源DNA。将其用于基因编辑，该技术以其简单，高效，精确等优势，迅速得到广泛应用，该技术也被评为生物学2013年10大突破之一。

该技术主要是通过向细胞内导入gRNA和Cas9蛋白实现对目标DNA的切割。gRNA是一个经过特殊设计的向导RNA，可以识别并结合靶基因DNA序列，Cas9蛋白是一个酶，可以与gRNA以及其识别的DNA结合，将目的DNA序列切断，再利用细胞DNA的损伤修复机制以及同源重组等机制，实现对DNA在断裂位点及附近进行突变，插入，替换等等修改，实现基因编辑的目的(参见文献:Mali,P.,Yang,L.,Esvelt,K.M.,Aach,J.,Guell,M.,DiCarlo,J.E.,Norville,J.E.,and Church,G.M.(2013).RNA-guided human genome engineering via Cas9.Science 339,823-826)。通常情况下，向细胞内导入Cas9蛋白是通过转染或感染Cas9表达载体而实现的，比如在细胞里转染Cas9表达质粒，而Cas9表达质粒在细胞内被转录为mRNA，进而翻译为Cas9蛋白，发挥结合gRNA，靶向切割DNA的作用。由此我们想到，Cas9的mRNA作为外源的核酸物质，会不会影响细胞内环境，对细胞产生影响？

mRNA和microRNA有广泛的相互作用，近年不断发现mRNA可以结合并吸附与其序列部分互补的microRNA，从而抑制这些microRNA，使得这些microRNA所抑制的mRNA表达上调(参见文献:Hansen,T.B.,Jensen,T.I.,Clausen,B.H.,Bramsen,J.B.,Finsen,B.,Damgaard,C.K.,and Kjems,J.(2013).Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges.Nature 495,384-388)。本发明人所在的实验室前期的实验也在胚胎干细胞中发现一条长链非编码RNA，lincRNA-RoR可以吸附mir-145，从而上调mir-145的靶基因：Oct4，Nanog等干细胞多能因子，维持胚胎干细胞的多能性(参见文献:Wang,Y.,Xu,Z.,Jiang,J.,Xu,C.,Kang,J.,Xiao,L.,Wu,M.,Xiong,J.,Guo,X.,and Liu,H.(2013).Endogenous miRNA sponge lincRNA-RoR regulates Oct4,Nanog,and Sox2in human embryonic stem cell self-renewal.Dev Cell 25,69-80)。因此，本发明人深知在存在序列部分互补的情况下，在mRNA表达量比较高的条件下，mRNA完全可以吸附microRNA，从而上调该microRNA的靶基因。