[发明专利]一种重组乙酰化阳离子型胰蛋白酶的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种重组乙酰化阳离子型胰蛋白酶的制备方法及其应用。采用本发明的制备方法制备的重组阳离子型猪胰蛋白酶和重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶具有高的酶活力，重组阳离子型猪胰蛋白酶的酶活力为27800BAEE单位/mg酶；重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶的酶活力为30200BAEE单位/mg酶；商品化猪胰蛋白酶的酶活力为9600BAEE单位/mg酶。本发明的制备方法具有酶产量高、特异性好、无动物来源病毒等有优点，生产与制备工艺简单、成本低，可以应用于生物制药和蛋白质组学研究。

技术领域

本发明涉及基因工程领域中一种重组乙酰化阳离子型胰蛋白酶的制备方法及其应用。

背景技术

胰蛋白酶(EC3.4.21.4)，是一种丝氨酸蛋白酶，在脊椎动物和无脊椎动物中广泛存在。在脊椎动物的胰脏中，胰蛋白酶以无活性的酶原(胰蛋白酶原)形式表达，经活化后形成胰蛋白酶。该酶可特异性的在蛋白质底物的赖氨酸和精氨酸的羧基端进行酶切水解，不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。胰蛋白酶在临床上可用于抗炎消肿，在工业上可用于皮革制造、生丝处理、食品加工等。此外还常用于动物细胞培养前对组织的处理和蛋白组学研究。

激活的胰蛋白酶被称为β-胰蛋白酶。β-胰蛋白酶可进一步地激活更多的酶原。β-胰蛋白酶除了可以对底物蛋白进行酶切外，也可以发生自消化。比较典型的是在Lys131-Ser132之间发生自切而产生α-胰蛋白酶。α-胰蛋白酶通过分子内二硫键继续维持完整的胰蛋白酶分子形态，但是其活性显著降低。另外，来源于胰脏的胰蛋白酶中还含有胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)。胰凝乳蛋白酶在胰蛋白酶的纯化中很难被完全去除，使得动物来源的胰蛋白酶具有了非特异性酶切的活性。为克服这种非特异的酶切活性，发展了TPCK处理方法，可淬灭纯化的胰蛋白酶产物中的胰凝乳蛋白酶活性。

在生物制药领域，病毒去除是整个生物制药工艺中非常关键的步骤。这使得对动物来源的原材料要求非常严格，极大地限制了动物来源的胰蛋白酶的应用。寻求可生产高活性、特异性强并且无动物来源病毒风险的胰蛋白酶的方法是目前亟待解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何制备高产量、高活性、高特异性和无动物来源病毒的胰蛋白酶并在此基础上对该胰蛋白酶进行乙酰化修饰获得更稳定的乙酰化产品。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了制备胰蛋白酶的方法。

本发明所提供的制备胰蛋白酶的方法，包括向受体大肠杆菌细胞中导入氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的胰蛋白酶原的编码基因，得到重组大肠杆菌细胞。对所述重组大肠杆菌细胞进行IPTG诱导，启动胰蛋白酶原基因的表达。收集所述重组大肠杆菌细胞，破碎所述重组大肠杆菌细胞，得到包涵体。对所述包涵体进行变性，得到变性后的样品；将所述变性后的样品进行复性，得到复性后的样品；将所述复性后的样品进行第一次纯化，得到纯化后的胰蛋白酶原；将所述纯化后的胰蛋白酶原进行激活，得到激活的胰蛋白酶；将所述激活的胰蛋白酶进行第二次纯化，得到纯化后的胰蛋白酶；

所述复性在复性缓冲液中进行。所述复性缓冲液的pH值可为7.0-9.0，具体可为7.5；所述复性缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷、尿素、胱氨酸和半胱氨酸；所述三羟甲基氨基甲烷在所述复性缓冲液中的浓度可为10-50mM，具体可为20mM；所述尿素在所述复性缓冲液中的浓度可为1-2M，具体可为2M；所述胱氨酸在所述复性缓冲液中的浓度可为1-2mM，具体可为1mM；所述半胱氨酸在所述复性缓冲液中的浓度可为3-5mM，具体可为3mM。