[发明专利]人或哺乳动物正常上皮细胞的培养基、培养方法、正常上皮细胞及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及细胞生物学和毒理学领域，具体涉及人或哺乳动物正常上皮细胞的培养基、原代分离培养、传代培养、气-液3D培养及基质胶3D培养方法，以及上述培养基、培养方法所生成的正常上皮细胞及其在毒理学评价系统中的应用。

背景技术

环境污染已经严重危害人们的身体健康，由此引发的呼吸系统疾病也不断出现。人的上皮细胞首当其冲成为主要的损害靶点。器官特异性分化的上皮细胞行使着重要的功能，如肺的气体交换、肾脏的滤过作用、肝脏的解毒和结合作用、胰岛细胞分泌胰岛素作用以及皮肤抵抗有害环境的作用。因此，基于上皮细胞的体外模型已经用来探究毒性物质职业暴露机制。在这些研究中用到了肺癌细胞系A549、结肠癌细胞系HT-29和染色体变异的细胞株，导致这些研究得到的结果相互间产生明显差异而引起争议。为了避免应用癌细胞带来的不利影响，学者们建立了各种细胞永生化的方法，他们试着在体外通过病毒或癌基因转导的方式建立了所谓“正常”的细胞系。然而，基因操作改变了细胞的遗传背景和真实的生理状态，不能反映正常上皮细胞的真实功能，因此得到的实验数据可靠性大大降低。

人体器官特异性分化的上皮细胞很难在体外进行培养。从组织样品中直接分离获得的上皮细胞产量和细胞纯度很低，这些原代和传代上皮细胞的增殖速度也极为有限，经过有限次的细胞传代后，就会停止增殖，发生衰老和死亡，这就限制细胞培养技术的进一步应用。如何获得来源于人体重要器官的正常细胞，是国内外基础与临床医学研究迫切需要解决的难题。虽然目前建立了很多细胞永生化方法，但大部分都是通过病毒导入、基因转染的方式将外源性病毒、原癌基因导入目的细胞，其基因组合是随机的，其表达产物可干扰细胞内生理途径，细胞发生非预期的改变，和正常细胞相比，其生物学性状如细胞核型、血清依赖型等可能发生改变，有的甚至表现出了肿瘤细胞的特性，建立的永生化细胞不能保持其原有的正常表型。然而迄今为止，在毒理学中还无法建立一种无基因导入永生化的正常细胞株作为研究模型。

发明内容

本发明的目的在于为克服现有技术的缺陷，而提供一种人或哺乳动物正常上皮细胞的培养基、原代分离培养、传代培养、气-液3D培养及基质胶3D培养方法，以及上述培养基、培养方法所生成的正常上皮细胞及其在毒理学评价系统中的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种用于培养人或哺乳动物的正常上皮细胞的培养基，所述培养基成分包括：DMEM与Ham’s F-12NUTRIENT MIX按体积比3:1混合的培养基，同时添加4-6％胎牛血清、1-3nM triiodothyronine,0.4-0.65％insulin-transferrin-selenium试剂、4-6μg/ml transferrin、9-11ng/mL表皮生长因子、0.3-0.5μg/mL氢化可的松、0.5-1.5nM霍乱毒素、0.4-0.6μg/mL两性霉素B、35-45μg/mL庆大霉素、45-55nM calpeptin、35-45ng/ml重组人IL-1RA及3ug/ml重组人R-Spondin-1。

一种人或哺乳动物的正常上皮细胞的原代分离培养方法，包括如下步骤：

S1、收集临床患者手术切除的正常细胞组织样品；或收集哺乳动物的正常细胞组织样品；

S2、配制消化液：所述消化液为含胶原酶/透明质酸酶混合液的权利要求1所述培养基；

S3、依次用乙醇和PBS缓冲液清洗分离的正常细胞组织样品，然后将正常细胞组织样品放入含预冷PBS缓冲液的无菌培养皿中，在解剖显微镜下，用解剖工具去除正常细胞组织样品中残留的脂肪；

S4、将正常细胞组织样品放入含步骤S2所配制消化液的离心管中消化；

S5、将消化后的正常细胞组织样品低速离心去除上清；

S6、将步骤S5处理后的正常细胞组织样品沉淀重悬于胰酶/EDTA中消化；

S7、然后再行加入含FBS的DMEM培养基，低速离心去除上清；

S8、加入分散酶和DNase I，用无菌的一次性塑料枪头反复吹打正常细胞组织样品；

S9、再行加入含FBS的DMEM，用过滤器过滤细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液，低速离心，去除上清；

S10、重悬步骤S9中的细胞沉淀于权利要求1所述的培养基中，接种于培养瓶培养。

具体的，人或哺乳动物的正常上皮细胞的原代分离培养方法

步骤S2中所述胶原酶/透明质酸酶是终浓度为1X的混合液；

步骤S3中先用95-100％的乙醇洗分离的新鲜组织1次，再用PBS缓冲液清洗2次；