[发明专利]人或哺乳动物正常上皮细胞的培养基、培养方法、正常上皮细胞及其应用

权利要求书

1.一种用于培养人或哺乳动物的正常上皮细胞的培养基，其特征在于，所述培养基成分包括：DMEM与Ham’s F-12NUTRIENT MIX按体积比3:1混合的培养基，同时添加4-6％胎牛血清、1-3nM triiodothyronine,0.4-0.65％insulin-transferrin-selenium试剂、4-6μg/ml transferrin、9-11ng/mL表皮生长因子、0.3-0.5μg/mL氢化可的松、0.5-1.5nM霍乱毒素、0.4-0.6μg/mL两性霉素B、35-45μg/mL庆大霉素、45-55nM calpeptin、35-45ng/ml重组人IL-1RA及3ug/ml重组人R-Spondin-1。

2.一种人或哺乳动物的正常上皮细胞的原代分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、收集临床患者手术切除的正常细胞组织样品；或收集哺乳动物的正常细胞组织样品；

S2、配制消化液：所述消化液为含胶原酶/透明质酸酶混合液的权利要求1所述培养基；

S3、依次用乙醇和PBS缓冲液清洗分离的正常细胞组织样品，然后将正常细胞组织样品放入含预冷PBS缓冲液的无菌培养皿中，在解剖显微镜下，用解剖工具去除正常细胞组织样品中残留的脂肪；

S4、将正常细胞组织样品放入含步骤S2所配制消化液的离心管中消化；

S5、将消化后的正常细胞组织样品低速离心去除上清；

S6、将步骤S5处理后的正常细胞组织样品沉淀重悬于胰酶/EDTA中消化；

S7、然后再行加入含FBS的DMEM培养基，低速离心去除上清；

S8、加入分散酶和DNase I，用无菌的一次性塑料枪头反复吹打正常细胞组织样品；

S9、再行加入含FBS的DMEM，用过滤器过滤细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液，低速离心，去除上清；

S10、重悬步骤S9中的细胞沉淀于权利要求1所述的培养基中，接种于培养瓶培 养。

3.根据权利要求2所述的人或哺乳动物的正常上皮细胞的原代分离培养方法，其特征在于，

步骤S2中所述胶原酶/透明质酸酶是终浓度为1X的混合液；

步骤S3中先用95-100％的乙醇洗分离的新鲜组织1次，再用PBS缓冲液清洗2次；

步骤S4中在离心管中消化的条件为37℃，时长1-3小时；

步骤S5中低速离心条件为低速为1000prm，时长为5分钟；

步骤S6中胰酶/EDTA为2-5ml，浓度为0.25％，置于冰上1小时或室温10分钟条件下重悬；

步骤S7的低速离心条件为低速为1000prm，时长为5分钟；

步骤S8中分散酶为2ml温浴的5mg/ml分散酶，DNase I为200μL的1mg/mL DNase I，吹打时长为1分钟；

步骤S9中所述DMEM为加入10ml含10％FBS的DMEM，低速离心条件为低速为1000prm，时长为5分钟；

步骤S10中培养条件为37℃，5％CO₂。

4.一种人或哺乳动物的正常上皮细胞的传代培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、当人或哺乳动物的正常上皮细胞增殖至70－90％丰度时，用1xPBS缓冲液洗涤细胞，再用胰酶/EDTA消化单层细胞；

S2、再用DMEM培养基中和消化反应；

S3、低速离心去除上清；

S4、以一定比例重悬细胞沉淀于权利要求1所述培养基中接种培养。

5.根据权利要求4所述人或哺乳动物的正常上皮细胞的传代培养方法，其特征在于，步骤S3处理后的细胞沉淀重悬于的细胞冻存液中,储存于液氮中备用。

6.根据权利要求4所述人或哺乳动物的正常上皮细胞的传代培养方法，其特征在于，

步骤S2中用1xPBS缓冲液洗涤细胞两次，所述胰酶/EDTA浓度0.05％，消化时长2-5分钟；

步骤S3中，低速离心条件为低速为1000prm，时长为5分钟；

步骤S4中，所选比例为1:2，1:3,1:4或1:5，只要维持细胞贴壁和正常生长即可。