[发明专利]用于检测蓝舌病病毒的基因芯片及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物芯片领域。具体而言，本发明涉及蓝舌病病毒的基因检测芯片及其检测方法。

背景技术

蓝舌病(Bluetongue disease,BT)是由蓝舌病毒(Bluetongue virus,BTV)引起的急性、烈性非接触性虫媒传染病。BTV主要感染绵羊、山羊、牛等家养和野生反刍动物,常见临床症状为高热、舌头变蓝和口腔粘膜水肿出血等。一般情况下，该病的死亡率为20％-30％，但对于某些品种的绵羊，致死率可高达90％，严重影响畜牧业的发展。蓝舌病病毒主要通过吸血昆虫(如库蠓等)吸吮带毒血液后叮咬易感动物进行传播,因此该病的爆发流行具有一定的季节性、地方性和周期性。另外，该病毒也可通过精液和胎盘进行垂直传播。蓝舌病是一种世界性危害的虫媒性传染病，OIE将其列为A类疫病，我国将其列为一类动物疫病，主要分布于美洲、非洲、澳洲及亚洲地区，我国也在云南、湖北、安徽、四川、山西、广西等多个地区分离得到BTV。近年来，随着全球气候变暖和国际动物贸易的逐年增加，蓝舌病在全球范围内有扩大流行的趋势，可感染多种动物，对畜牧业生产发展和人类健康构成严重威胁。

蓝舌病病毒属于呼肠孤病毒科环状病毒属,病毒粒子呈二十面体对称,无囊膜，由10个节段的双链RNA组成，编码7种结构蛋白和4种非结构蛋白，为迄今为止分子量最大的RNA病毒。目前已证实BTV至少存在24个血清型，各血清型间交叉保护力低。另外，蓝舌病病毒常与小反刍兽疫、水疱性口炎、猪水疱病毒等混合感染，大大增加对该病的诊断难度。我国蓝舌病的诊断和检疫的标准(GB/T18636-2002)方法主要有病毒的分离鉴定、抗原捕获ELISA(抗原捕获ELISA)、定型微量中和试验和空斑及空斑抑制定型试验等用于病原的检测，琼脂免疫扩散试验(AGID)和竞争ELISA(C-ELISA)用于抗体的检测。病毒分离鉴定是OIE推荐的诊断BTV的方法之一，但是该方法存在培养周期长的局限性。血清学检测方法可用于病毒分离物的血清型鉴定，也可用于BTV特异性抗体的检测。BTV核酸检测技术包括通用型检测和分型检测，主要包括核酸探针技术、RT-PCR、荧光定量PCR、基因芯片检测技术等。蓝舌病尚无有效的治疗方法和疫苗，早发现、早处理依靠于快速、准确的检测手段。因而能够准确快速检测出BTV，在动物及其副产品的进出口检疫中具有重要的意义。

基因芯片(Gene chip)是由DNA或寡核苷酸探针密集排列在经过共价结合醛基、氨基或多聚赖氨酸的固相支持物所形成的探针阵列，在适当的温度、湿度条件下，利用特异性探针与经过适当方式标记的待检样品DNA通过碱基互补配对杂交，然后通过相应的检测设备，检测杂交信号的位置和强弱，判断样品种类，完成病毒检测和基础研究等方面的工作。该方法具有高通量、平行化、微量化、自动化、低成本的优点。因此，该技术被广泛应用于诊断检测、差异表达分析、测序等诸多领域。

发明内容

为了克服现有技术中的不足，本发明的目的是建立一种灵敏度高、特异性强、节时省力并且易于观察结果的微阵列芯片，检测蓝舌病病毒的基因芯片。

为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：用于检测蓝舌病病毒的基因芯片包括：PCR反应混合液管、Taq聚合酶、PCR阳性对照、PCR阴性对照、ddH₂O、检测芯片、芯片探针的点样分布、芯片盖片、芯片围栏、杂交液、杂交阳性对照、杂交盒，采用基因芯片微量点样技术，将待测样品探针与各种质控探针固定在经过化学修饰的醛基基片上，形成的微阵列。微阵列包括质控探针区和待测样品探针区，其中所述质控探针区内设置下述分区：

点样位置质控分区P1，包含至少一个点样位置质控探针:SEQ ID NO.2；

杂交阳性质控分区P2，包含至少一个杂交阳性质控探针:SEQ ID NO.3；

杂交阴性质控分区N，包含点样缓冲液；

所述待测样品探针区包含至少一个蓝舌病病毒探针：SEQ ID NO.1。

利用上述基因芯片检测蓝舌病病毒的检测方法，具体步骤如下：

(1)待测样品制备：按照商品化RNA提取试剂盒使用说明书提取待测组织或病毒的细胞增殖液的全基因组，进行反转录制备cDNA，获得待检样品DNA；

(2)PCR扩增：25μL PCR反应液包含:rTaq酶12.5μL、引物Mix 5.4μL、待测样品DNA 3μL、无核酸酶灭菌水4.1μL；

其中，所述引物Mix含有：

20μmol/L蓝舌病病毒特异上游引物SEQ ID NO.4 0.2μL,