[发明专利]一种脂肪酶的原核表达及应用和固定化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种脂肪酶的原核表达及应用和固定化方法，属于酶工程及分子生物学应用领域。

背景技术

脂肪酶是一类能够催化酯键水解及合成的丝氨酸水解酶类，广泛存在于动物、植物、微生物中。然而微生物脂肪酶具有动、植物不可比拟的特点：具有种类来源丰富，生产成本低，pH和温度稳定性范围广，底物特异性广等，其广泛运用于食品、油、脂肪、手性化合物、皮革、化妆品、生物柴油等工业生产。然而现在绝大部分工业酶是来自于嗜温微生物中，不适合恶劣的工业生产程序，例如在有机试剂，高温等环境中。

酶的生物催化热稳定性允许酶催化反应在高温环境下进行，这高温环境下进行生物催化反应具有明显的优势：1.较高的扩散率；2.增加脂质和其他疏水性底物在水环境中的溶解度；3.减少基质的粘度；4.增加反应物的溶解度；5.高温环境下更高的反应效率；6.降低微生物污染的风险。在有机溶剂中，脂肪酶催化转酯作用是一种新型工业化应用，例如，生产类可可脂，母乳替代品“Betapol”，和生物柴油等等，其中一种非常有效的生物柴油生产方法是在无溶剂系统中利用脂肪酶催化废油脂与甲醇的转酯反应，然而甲醇对酶具有毒害作用，容易使酶失活，为此脂肪酶在有机溶剂中的活性及稳定性是其在工业生物催化领域中重要的性质。

为了考虑生物催化的应用，研究并发现新酶及其生物学性质是非常重要的，而来源极端微生物中的酶具有很高的内在热稳定性和化学稳定性，为此来源极端微生物中的酶的生产及酶学性质的研究引起学者的广泛研究。目前，一些极端嗜热菌的基因组已经被完全测序，如海栖热袍菌（Thermotoga maritima MSB8），甲烷嗜热菌（Methanopyrus kandleri AV19），敏捷气热菌(Aeropyrum pernix)等等，其中一些羧酸水解酶已经被分离和定性，显示出高的热稳定性及不同化学稳定性，为工业生物催化提供了重要的酶来源。

虽然热稳定性脂肪酶在工业催化中具有很大的应用前景，由于工业化生产中追求的是低成本，高效益，所以游离的脂肪酶不适合工业化生产要求，为此发明了酶的固定化技术和细胞表面展示技术。酶的固定化技术是将酶吸附或者共价结合在固体材料上面，或者将酶截留在有机或无机聚合物上，其一个非常重要的途径去提高酶的稳定性，循环利用性等等，然而其中带有一些不可忽视的缺点：酶固定化程序中成本高并且耗时长，回收利用时酶活力的丧失等。营养细胞表面展示是通过基因操作技术使外源蛋白与膜或者细胞壁上运载蛋白共表达，从而实现了外源蛋白在细胞表面的定位，此技术使不仅外源蛋白保持相对独立的空间结构和生物活性，同时也利于酶的回收利用。但是外源蛋白展示在细胞表面需要进行跨膜转运，所以多聚体或大分子量蛋白很难展示在细胞表面，同时营养体细胞在恶劣环境下容易破裂，不易回收利用。

枯草芽孢杆菌孢子为内生，在初始孢子化时，前孢子体借助母细胞表达的衣壳蛋白组装成成熟孢子体，然后使母细胞破裂，释放成熟孢子，经过简单的离心就可以获得孢子体。而且孢子具有独特的抗逆性，能很好的抵抗高温、强酸、强碱等不良环境的影响而长期保持孢子状态。根据孢子的特性，近年来，新兴起了一门表面展示技术即枯草芽孢杆菌孢子表面展示技术，其是基于细胞表面展示技术的原理，外源蛋白随着衣壳蛋白共表，然后组装成孢子最外层的衣壳，从而实现了外源蛋白不需经过跨膜转运就能实现在孢子表面的定位，该技术能很好的解决上述所呈现问题。

起初，枯草芽孢杆菌孢子表面展示技术是用于口服疫苗及免疫原性的研究，Racele isticato等*(Isticato R, Cangiano G, Tran HT, Ciabattini A, Medaglini D, Oggioni MR, De Felice M, Pozzi G, Ricca E (2001) Surface display of recombinant proteins on bacillus subtilis spores. J Bacteriol 183: 6294-6301.)最先以CotB为锚定蛋白将破伤风毒素碳末端（TTFC）的459个氨基酸片段展示在孢子表面，并且将该孢子饲喂小鼠后，在小鼠血清内检测到抗TTFC 的IgG，说明了通过口服孢子表面展示的抗原在生物体能具有很好的免疫效果。为此学者对孢子表面技术深入的研究并发现了其他的一些衣壳运载蛋白，如CotC, CotG, CotX, CotE 和 OxdD，但是主要还是用于免疫原性的研究。