[发明专利]一种脂肪酶的原核表达及应用和固定化方法

权利要求书

1.一种脂肪酶Tm1350的固定化方法，其特征在于，按照以下步骤进行：

（1）构建一个以CotB为锚定蛋白的高拷贝大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体pHS-CotB；

（2）将脂肪酶Tm1350基因与步骤（1）中的穿梭表达载体相连，得到重组表达载体pHS-cotB-Tm1350；

（3）将重组表达载体pHS-cotB-Tm1350转入宿主菌株枯草芽孢杆菌DB403中，得到孢子表面展示脂肪酶的重组枯草芽孢杆菌；

所述脂肪酶Tm1350基因来源于极端嗜热菌海栖热袍菌脂肪酶Tm1350基因，其中脂肪酶Tm1350基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.一种权利要求1获得的穿梭表达载体pHS-CotB。

3.根据权利要求1所述的一种脂肪酶Tm1350的固定化方法，其特征在于，所述穿梭表达载体pHS-CotB含有大肠杆菌复制起点，氯霉素抗性基因，枯草芽孢杆菌复制、转录起始位点以及CotB基因的调控表达序列和结构蛋白序列；

所述穿梭表达载体pHS-CotB是以诱导型表达载体pLJ为模板，进行PCR扩增获得一条不含有乳糖诱导调控序列Pglv-inframe的质粒骨架片段，且在扩增时在片段的两端同时引入Eco RI酶切位点，并酶切、纯化，经T4DNA连接酶自环化成质粒pHS；再以CotB-up (Xma I): 5’-TAGCCCGGGACGGATTAGGCCGTTTGTCC-3’，

CotB-down (SpeI ):5’-CGGACTAGTTGAACCCCCACCTCCGTAGTGTTTTTTATGCTT-3’为引物，在质粒pHS的多克隆位点Xma I和Spe I之间插入枯草芽孢杆菌的自带有完整的诱导调控序列的衣壳蛋白cot B基因，形成一种高效的芽孢展示载体平台pHS-cotB。

4.一种权利要求1获得的重组表达载体pHS-cotB-Tm1350，其特征在于，所述重组表达载体包含脂肪酶Tm1350基因序列和权利要求2所述的穿梭表达载体pHS-CotB。

5.一种孢子表面展示脂肪酶Tm1350基因的重组枯草芽孢杆菌DB403（pHS-cotB-Tm1350），其中在于，所述重组枯草芽孢杆菌包含权利要求4所述的重组表达载体pHS-cotB-Tm1350。