[发明专利]一种构巢曲霉AclxA基因的用途

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种构巢曲霉AclxA基因的功能和用途。

技术背景

由于广谱抗生素的广泛应用、器官移植的不断应用和艾滋病等免疫缺陷型病人的增多，侵袭性真菌感染的发生呈上升趋势。在免疫受抑制或缺陷的病人群体中，患有侵袭性曲霉病的人群占2-10％。全球有300-400万人患有慢性肺曲霉病和过敏性肺支气管曲霉病。曲霉属中烟曲霉、土曲霉和构巢曲霉等都可以引发曲霉病。由于构巢曲霉是曲霉属的模式物种，通过研究构巢曲霉中基因功能和用途可以为其它曲霉基因功能和应用提供借鉴。曲霉之所以能够成功侵染人类宿主的一个重要原因是其高温适应能力(很多真菌在体温37℃不能生长)

钙离子信号通路在真核生物中广泛存在，并且构成一个复杂的网络体系。在真菌细胞中，有一套依赖于钙离子的逆境胁迫应答信号通路，其中研究较为清楚的一条途径为CCS(Cell Calcium Survival)途径。钙离子作为第二信使，是调节细胞功能的重要引发因子，参与多种生理、生化反应，使得细胞能够得以在逆境下存活下来。钙连接蛋白作为一种分子伴侣定位在内质网(endoplasmic reticulum)，对分泌蛋白质的正确折叠起着一定作用。作为CCS(Cell Calcium Survival)途径中的一员，钙连接蛋白广泛的存在于真核生物中，在构巢曲霉中钙连接蛋白基因为AclxA，其功能未知。因此，通过对丝状真菌逆境响应过程中钙信号系统的调控作用进行研究，可以更进一步了解真菌应对外界环境包括热适应能力的分子调控机制。

发明内容

本发明的目的在于提供构巢曲霉AclxA基因，以及该基因在构巢曲霉对高温适应性响应的影响，并构建获得了一种构巢曲霉高温敏感菌株。

本发明研究发现，AclxA在构巢曲霉的热适应性机制上发挥重要作用，AclxA缺失菌株在高温下生长和产孢受到抑制。AclxA缺失菌株在高温下生长和产孢受到抑制是钙浓度依赖性的。通过控制钙离子的浓度可以改变AclxA缺失菌株对热的耐受性。

本发明公开了构巢曲霉AclxA基因，其序列如SEQ ID NO：1所示。该基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO：2所示

本发明公开了构巢曲霉AclxA基因的用途，用于构建AclxA基因缺失菌株，或用于制备、筛选曲霉病的治疗药物。

本发明所述构巢曲霉AclxA缺失菌株中，AclxA基因通过同源重组的方法敲除。与野生型构巢曲霉相比，所述缺失菌株在高温下的生长和繁殖都受到抑制。

AclxA缺失菌株为高温敏感性菌株，其中AclxA基因不表达。

本发明所述曲霉病治疗药物以AclxA基因为治疗靶基因，使AclxA基因不表达的药物可以抑制曲霉在人体内的增殖。或者以AclxA基因为靶点筛选制备使该基因不表达的药物，用于曲霉病的治疗。

本发明还公开了前述构巢曲霉高温敏感性菌株在研究构巢曲霉钙信号通路中的功能，以及在制备和筛选曲霉病治疗药物中的作用。

附图说明

图1：构巢曲霉AclxA基因的敲除策略。

图2：高温下，构巢曲霉AclxA基因的敲除对菌落生长和产孢的影响。

图3：高温下，外加CaCl₂时构巢曲霉AclxA基因缺失株菌落生长表型。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施案例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

1、测试菌株

表1使用菌株情况列表

2、测试培养基

丰富培养基YAG(每升含酵母粉5g,葡萄糖20g，微量元素1ml,固体培养基加入2％琼脂粉，w/v)，YUU为在此基础上加入1.1g/L尿苷(U)及1.2g/L尿嘧啶(U)。

基本培养基MMPDR(每升含20Xsalt溶液50mL，微量元素1ml，葡萄糖10g，吡多醇1ml(0.5mg/ml储备液)，核黄素1mL(2.5mg/mL储备液)，调节pH至6.5)。MMPDR+UU为在此基础上每升加入1.1g尿苷及1.2g尿嘧啶。

3、基本实验方法

方法1：构巢曲霉基因组DNA提取