[发明专利]基因II型草鱼呼肠孤病毒的检测方法及检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及水生动物病毒领域中的疫病诊断技术，具体涉及基因II型草鱼呼肠孤病毒的RT-LAMP-LFD检测方法及其检测试剂盒。

背景技术

草鱼出血病(Hemorrhage of Grass Carp)是草鱼养殖业一种严重的病毒性出血病，对草鱼养殖产业造成重大威胁，其流行季节在每年5月初和10月底之间，水温在20℃开始流行，最适流行水温为27℃-30℃，死亡率可达50％-80％，据不完全统计，每年由于草鱼出血病导致的经济损失达21.26亿元，该病已被中国农业部列入二类动物疫病病种名录。该病病原为草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus，GCRV)，该病毒为中国分离鉴定的第一株鱼类病毒，隶属于水生呼肠孤病毒属(Aquareovirus，ARV)，是该属成员中毒力最强的病毒，是中国在国际上首次完成全基因序列分析的第一株水生呼肠孤病毒，也是迄今研究得最系统深入的水生呼肠孤病毒，该病毒为双链分节段RNA病毒，基因组分11个节段。研究表明，根据GCRV分离株基因序列的特征，目前临床上共存在三种基因型GCRV，包括以GCRV873为代表的基因I型，以HZ08、GD108为代表的基因II型，以HGDRV(Genbank中为GCRV104)为代表的基因III型。

大量样品检测结果表明，临床流行的毒株为I型和II型，在这之中由于基因II型草鱼出血病死亡快，死亡率高，发病状态上表现为肠出血和肌肉出血，外表症状不明显，导致很难实现该疾病的及时检测，高死亡率带来了巨大的经济损失。目前，用于该基因型GCRV的检测方法有电镜法、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测法、多重RT-PCR方法等。但在实际检测工作中，现有的检测技术存在以下问题：一是灵敏度不够，无法检测到潜伏感染样品；二是容易产生假阳性，对模板质量要求高；三是操作繁琐，对实验条件要求高，不利于养殖户和一线生产技术人员来操作。

RT-LAMP是核酸等温扩增检测技术，依据环介导等温核酸扩增技术(LAMP)的原理，针对靶基因的特定区域设计4条特异性引物，利用具有链置换特性的DNA聚合酶和AMV逆转录酶使RT和LAMP反应在同管中同时进行，简化了操作步骤，在等温条件下就可以高效、高特异地扩增靶序列。LAMP产物的检测一般采用琼脂糖凝胶电泳、浊度观察、荧光染料观察等方法。横向侧流(Latteral flow detect，LFD)试纸条是一种检测产物的新方法，利用反应体系中的FITC标记的探针与生物素标记的LAMP扩增产物特异性杂交，减少了电泳环节、染料颜色的人为目测差异以及由非特异性扩增造成的假阳性问题。

尽管单独来说上述两种技术近年来得到了初步应用，但是针对具体的病毒检测的适用条件尚需要广泛深入的探索，目前本领域尚未有在基因II型草鱼呼肠孤病毒检测上使用上述技术的先例。早期国内曾研究了基因III型的草鱼呼肠孤病毒RT-LAMP检测试剂盒CN201210186709.6，一方面基因III型临床很少见，这种检测试剂盒并无市场需求；另一方面，该方案的引物无法用于扩增其它的草鱼呼肠孤病毒，将上述所公开的引物扩增基因II型草鱼呼肠孤病毒特异性太差，无法用于LFD试纸条检测。本领域也曾有尝试研究艾滋病病毒的RT-LAMP-LFD检测方法，但是由于艾滋病病毒与基因II型草鱼呼肠孤病毒存在巨大的序列差异，其所用的探针对其他检测无任何参考价值。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种针对基因II型草鱼呼肠孤病毒的检测方法，通过所使用的两对引物和特异性探针，高效、高灵敏度的实现基因II型草鱼呼肠孤病毒的检测。

本发明的另一个目的是提供一种基因II型草鱼呼肠孤病毒的检测试剂盒，该试剂盒内置了实现基因II型草鱼呼肠孤病毒的RT-LAMP-LFD检测所用的预混反应液，在使用时加入基因II型草鱼呼肠孤病毒的RNA样品即可实现快速、准确检测。

为实现上述发明目的，本发明是通过如下技术方案实现的：