[发明专利]一种用于区分梨品种的RAPD引物及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种利用RAPD分子标记技术快速区分梨品种的方法。

背景技术

中国是世界梨属植物的起源中心之一，梨树的栽培面积和产量均居世界首位。近年来，随着我国梨产业的快速发展，大量的优良品种应用于梨生产中，但由于长期的人工栽培过程导致梨品种品系混杂现象严重，给梨树品种选育与资源鉴定、亲缘关系及遗传多样性评价带来不便，因此，建立梨品种高效快速可靠的鉴定技术体系对于苗木早期鉴定、区分品种以及对品种权进行保护都至关重要。

目前，仅仅依靠传统单一的田间形态学品种鉴定方法已难以对当今诸多品种进行有效鉴别。近年来，随着生物技术的不断发展，诞生了一系列DNA分子标记技术，分子标记直接以DNA的形式表现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否的问题，其检测到的多态性位点是无限的，结果具有高度的可靠性，且重复性高，鉴别力强，自从分子标记出现以后，它已成为品种鉴定、纯度检测及指纹图谱分析有力的工具。分子标记的应用给作物遗传育种研究带来了巨大变化，同时也应用到了品种鉴定的研究中。

随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD)发展历史长，是应用较早的分子标记技术之一，它基于PCR技术，分析程序较简单便捷，周期性短，无放射性，所需费用低，不易受外界环境影响，且无需对基因组序列进行预知等优势，已被广泛应用于基因的快速定位、指纹图谱构建、基因连锁标记、遗传多样性分析，品种分类研究等方面。

现有的利用RAPD技术进行品种区分与种质鉴定的研究工作中，多采用计算机软件绘制数字化指纹图谱，通过聚类分析得出聚类树，此聚类分析的结果不但无法直观显示出区别多个品种所用到的引物，且无法显示鉴别过程，其操作量大，缺乏实用性。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是：提供一种利用RAPD技术区分梨品种的引物。

本发明还要解决的技术问题是：提供利用上述引物区分梨的品种的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种用于区分梨品种的RAPD引物包括如下引物序列：

P3：5’-CTTGCTATGGT-3’；

P12：5’-GCACAAGATGA-3’；

P32：5’-GTAGGTGTCAC-3’。

上述用于区分梨品种的RAPD引物在区分梨品种中的应用在本发明的保护范围之内。

利用上述P3、P12、P32引物区分梨品种的RAPD方法，包括如下步骤：

(1)提取梨的基因组DNA；

(2)利用P3引物对步骤(1)得到的基因组DNA进行RAPD扩增，得到的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，若在550bp、1500bp处都出现特征性谱带，而在700bp和1000bp无特征性谱带，梨的品种为“玉露香”；若在1500bp、1000bp、700bp处都出现特征性谱带，而550bp无特征性谱带，梨的品种为“红香酥”；若在1500bp、700bp出现特征性谱带，而1000bp、550bp无特征性谱带，梨的品种为“苏翠2号”；

(3)若琼脂糖凝胶电泳检测结果与步骤(2)不符，则利用引物P12再对基因组DNA进行RAPD扩增，

若在550bp、1000bp、1500bp都出现特征性谱带，而在700bp处未出现特征性谱带，利用引物P12扩增后，经琼脂糖凝胶电泳检测在1000bp出现特征性谱带的，其品种为“翠玉”；在1000bp无特征性谱带的，其品种为“玉绿”；

若在550bp、700bp、1000bp都出现特征性谱带，而在1500bp处未出现特征性谱带，利用引物P12扩增后，经琼脂糖凝胶电泳检测在1800bp、1500bp均出现特征性谱带，其品种为“寒红”；若在1500bp、1000bp处出现特征性谱带，其品种为“丰水”；若仅在1000bp处出现特征性谱带，其品种为“寒香”；