[发明专利]用于制备乳酸片球菌素Pediocin的重组菌、制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及微生物生物技术领域，具体涉及用于制备乳酸片球菌素Pediocin的重组菌、制备方法及应用。

背景技术

细菌素是一类由核糖体产生的具有抑菌活性的蛋白质或多肽，在革兰氏阳性和革兰氏阴性菌中广泛存在，其对目标细菌的抑制具有低浓度和高效性的特点。在对化学防腐剂的安全隐患越来越重视的今天，食品级微生物来源的细菌素作为生物防腐剂的应用符合消费者对于安全、健康和天然的要求。

来源于乳酸片球菌、能够专一性抑制李斯特菌的细菌素Pediocin，在食品工业中有重要的潜在应用价值。采用乳酸片球菌发酵制备Pediocin，发酵液中目标产物浓度较低，发酵液成分复杂，因此分离有活性细菌素的过程耗时费力，成本高，且纯度难以保证。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于制备乳酸片球菌素Pediocin的重组菌，该重组菌构建方便，在诱导条件下能够高效表达带有纯化标签的重组乳酸片球菌素Pediocin，菌体裂解液成分简单，有利于通过亲和色谱进行高效分离，水解酶切位点后得到具有活性的乳酸片球菌素Pediocin。

本发明的另一目的是提供所述重组菌的制备方法，该方法简单，效率高。

本发明的再一目的是提供制备乳酸片球菌素Pediocin的方法，诱导培养重组菌后，仅需要通过简单的亲和色谱就能够高效分离乳酸片球菌素Pediocin，水解后除去纯化标签，就能够获得大量、高纯度、有活性的细菌素。

本发明的目的通过以下技术方案实现。

本发明提供用于制备乳酸片球菌素Pediocin的重组菌，所述重组菌携带由乳酸片球菌素Pediocin、纯化标签和酶切位点相连形成的融合蛋白的编码基因。

在本发明中，所述纯化标签通过酶切位点连接在乳酸片球菌素Pediocin的一端或两端。

在本发明中，所述纯化标签是GST标签，或者所述纯化标签是由GST标签通过酰胺键与His标签相连而成；所述酶切位点是肠激酶酶切位点。

优选的技术方案中，所述纯化标签是GST标签通过酰胺键与His标签相连而成，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

另一优选的技术方案中，所述纯化标签是GST标签，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明还提供所述重组菌的制备方法，将由乳酸片球菌素Pediocin、纯化标签和酶切位点相连形成的融合蛋白的编码基因插入表达载体得到重组载体；将所述重组载体转化大肠杆菌，得到所述重组菌。

优选的技术方案中，所述重组载体是将由乳酸片球菌素Pediocin、酶切位点相连形成的融合蛋白的编码基因插入表达载体pGEX-6P-1后获得。

本发明还提供制备乳酸片球菌素Pediocin的方法，诱导所述重组菌表达由乳酸片球菌素Pediocin、纯化标签和酶切位点相连形成的融合蛋白，破碎所述重组菌得到裂解液，离心取上清液，采用HisTrap HP柱和GSTrap 4B柱分离或者采用GSTrap 4B柱分离，收集含有由乳酸片球菌素Pediocin、纯化标签和酶切位点相连形成的融合蛋白的洗脱峰，采用肠激酶酶解，除去酶解液中的纯化标签，得到乳酸片球菌素Pediocin。

本发明巧妙构建了制备乳酸片球菌素Pediocin的重组菌，在诱导条件下能够高效表达带有纯化标签的重组乳酸片球菌素Pediocin，菌体裂解液成分简单，有利于通过亲和色谱进行高效分离，水解酶切位点后得到具有活性的乳酸片球菌素Pediocin。

本发明制备乳酸片球菌素Pediocin的方法，是通过诱导重组菌表达带有纯化标签的重组乳酸片球菌素Pediocin，然后采用亲和色谱分离，水解并除去纯化标签，就能够获得大量、高纯度、有活性的细菌素，该细菌素的结构和功能与天然乳酸片球菌素Pediocin完全一致。携带有GST标签和His标签的重组Pediocin的分离纯化效果显著好于仅含有GST标签蛋白的重组Pediocin，前者得到的乳酸片球菌素Pediocin纯度也显著高于后者。

附图说明

图1为携带有乳酸片球菌素Pediocin基因的重组表达载体构建过程，其中pedAB是Pediocin的基因（包括结构和免疫基因），Ptac为乳糖操纵子和色氨酸操纵子的杂合启动子；GST为GST标签编码基因的缩写，His是His标签编码基因的缩写。

图2为重组菌1的重组Pediocin粗提液采用HisTrap HP柱分离纯化的色谱图，其中A280表示流出液在280 nm波长下的吸收值。