[发明专利]用于乙型肝炎病毒感染治疗的导向RNA靶点

说明书

技术领域

本发明一般涉及分子生物学、细胞生物学和基因治疗领域。更具体地，本发明涉及用于乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染治疗的15个导向RNA(short guide RNA，gRNA)靶点，通过这些靶点获得的导向RNA及其重组表达载体，以及应用这些靶点和导向RNA以各种方式获得的用于HBV感染治疗的药物和方法。

背景技术

目前针对HBV的抗病毒药物为核苷酸类似物和干扰素。虽然，核苷酸类似物(Nucleotide，NAs)可通过抑制HBV聚合酶的活性高效抑制HBV复制，但其对HBV共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，cccDNA)无作用，由于cccDNA是HBV复制的模版，其半衰期可达数年至数十年，所以短期内NAs不能清除HBV，机体免疫力低下或耐药等因素均可诱发HBV再激活和肝炎复发。尽管，干扰素α(IFN-α)可清除一部分感染者体内的HBV，且体外实验证实高剂量的IFN-α可降解cccDNA，但其清除比例较低(＜8％)，且由于高剂量的IFN-α具有很强的副作用，机体不能耐受。因此，HBV cccDNA是慢性乙型肝炎(乙肝)治疗过程中的一大障碍，目前尚无高效清除HBV cccDNA的方法。

CRISPR/Cas系统，是最近几年来发展起来的一种新的可对基因组DNA进行靶向编辑的工具。该系统原本是存在于细菌中的一种对付病毒等外来DNA的防御系统。在一些细菌基因组中存在一系列成簇排列的DNA序列，被称作“规律间隔成簇短回文重复序列”(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)。这些重复序列的间隔序列，被发现和很多能够侵入细菌的噬菌体DNA序列相同。并且，这些序列在被转录成为RNA后，能够与宿主细菌产生的一类称为Cas(CRISPR associated)的蛋白质形成复合体，来对Cas蛋白起到导向作用，因此这段RNA也被称为导向RNA(guide RNA，gRNA)。当复合体检测到入侵的DNA和gRNA序列一致时，CRISPR/Cas系统可以识别外源核酸中的特殊片段，该特殊片段中含有原型间隔序列毗邻基序(即Protospacer Associated Motif，PAM)。Cas蛋白由此到达PAM识别序列的特定位点而对外来DNA进行定点、特异的切割，达到DNA序列的修饰或者编辑的目的。

严格来说，在细菌体内gRNA由两部分组成：一部分为来自于间隔区、识别入侵DNA的crRNA(CRISPR RNA，crRNA)，另一部分为活化Cas蛋白所需的tracrRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)。在人工构建的CRISPR-Cas9系统载体中，这两段RNA可融合为一条，称为导向RNA(guide RNA，gRNA)。

细菌中的CRISPR-Cas系统极为多样，而一个来自产脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的由Cas9蛋白参与的系统被人们研究的最为透彻。因此人们对它进行了改造，将编码Cas9蛋白的序列及其附属元件共同制造成为一个单一的载体。在转入宿主细胞后，产生的人工构建的gRNA就能指导Cas9蛋白切割宿主细胞特定的DNA序列，从而起到基因编辑的作用。

以CRISPR-Cas系统为基础将有望开发出新型的更有效地用于HBV感染治疗的方法，该方法需要提供有效清除HBV cccDNA的gRNA靶点。本发明满足了这一要求，提供了用于该目的的gRNA靶点、gRNA和重组表达载体等。

发明内容

为了解决以上问题，本发明提供了靶向HBV的gRNA靶点，用于构建包含或互补本发明涉及的gRNA靶点的表达载体、重组载体和宿主细胞，以及可获得用于获得包含有由本发明涉及的gRNA靶点获得的治疗药物。

本发明提供的gRNA靶点可靶向HBV，可破坏共价闭合环状DNA并抑制HBV复制。本发明提供的gRNA靶点是通过以下方法获得的：选择设计可靶向HBV的gRNA靶点序列，通过设计合适的引物构建gRNA，并克隆入表达载体获得相应的gRNA表达载体，将该载体分别与HBV表达载体进行共转染实验，通过检测HBV表面抗原水平及鉴定抑制特异性等分析筛选获得合适的gRNA靶点。

本发明提供一种靶向HBV的导向RNA靶点序列，其选自以下序列之一：

(1)SEQ ID NOs：1-15中任一个所述的序列；