[发明专利]一种缺失sfp基因的生防菌及其发酵工艺和应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种缺失sfp基因的生防菌及其发酵工艺和应用。

背景技术

芽孢杆菌是一类产生芽孢的革兰氏阳性菌株，它的分布广泛，生理特征丰富，易于分离和培养，是自然界中重要的微生物菌群，芽孢杆菌可以产生多种抗菌活性物质，包括由非核糖体途径合成的非核糖体肽类抗生素以及由核糖体途径合成的细菌素、酶类及其他活性蛋白类抗菌物质等。

168菌株是芽孢杆菌的模式菌株，也是目前研究的最为透彻的菌株，他的全基因组已于1997年测序完成。与野生芽孢杆菌不同的是模式菌株168由于在实验室的长期继代培养，发生了很多的自发突变因而丧失了很多野生型的特点，比如sfp基因的自发突变，使得168菌株丧失了产生脂肽类化合物的能力，因而缺失了抑菌的能力。sfp基因编码的4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶，是芽孢杆菌非核糖体途径合成脂肽类化合物的关键基因。

本研究的目标菌株HAB-2经过一系列的前期实验表明：该菌株没有sfp基因，但是通过现代的仪器分析手段我们又在HAB-2发酵液中检测得到了由于sfp缺失而不可能得到的脂肽类物质——表面活性素类物质，这就说明本研究的生防菌HAB-2具有特殊的代谢脂肽类的代谢途径，值得进一步的深入研究。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种生防菌，其缺失sfp基因，但是具有产生脂肽类化合物的能力，具有极高的研究价值。本发明的另一目的是提供该生防菌的发酵工艺。本发明的再一个目的是提供该生防菌的发酵物活性成分的提取方法，本发明的最后一个目的是提供该生防菌的应用。

本发明的第一个方面是提供一种缺失sfp基因的生防菌，为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HAB-2，保藏编号为：CCTCC M 2015070。

本发明第二个方面是提供本发明第一个方面所述的生防菌的发酵工艺，将本发明第一个方面所述的生防菌接种于液体的溶菌肉汤培养基中，在26～30℃的条件下，50～500转/分钟摇菌1～3天，即得到发酵液。

优选地，还包括前处理步骤：先将本发明第一个方面所述的生防菌接种于溶菌肉汤培养基上26～30℃下活化培养1～6天。

本发明的第三个方面是提供本发明第一个方面所述的生防菌的发酵物活性成分的提取方法，包括以下步骤：

步骤1，采用本发明第二个方面所述的发酵工艺制得发酵液，然后离心除去菌体，得到无菌发酵液；

步骤2，无菌发酵液用正丁醇萃取，取萃取液，浓缩除去正丁醇，即得。

本发明的第四个方面是提供另一种本发明第一个方面所述的生防菌的发酵物活性成分的提取方法，包括以下步骤：

包括以下步骤：

a，采用本发明第二个方面所述的发酵工艺制得发酵液，然后离心除去菌体，得到无菌发酵液；

b，无菌发酵液用盐酸调节pH至1.5～3，1～10℃下静置至少3h；

c，离心，弃去上清液，取沉淀，即得。

本发明的第五个方面是提供又一种本发明第一个方面所述的生防菌的发酵物活性成分的提取方法，包括以下步骤：1)采用权利要求2～3任意一项所述的发酵工艺制得发酵液，然后离心除去菌体，得到无菌发酵液；

2)缓慢加入饱和硫酸铵，沉淀蛋白，1～10℃下静置至少3h；

3)离心得到沉淀，待沉淀干燥后用1/5～1/20原发酵液体积的、pH值为6～8的Tris-HCl溶解沉淀，即得。

本发明的第六个方面是提供本发明第一个方面所述的生防菌在制备脂肽类抑菌制剂中的应用。

本发明的第七个方面是提供本发明第一个方面所述的生防菌在制备防治植物真菌病害制剂中的应用。

其中，所述植物真菌病害为番茄早疫病、西瓜枯萎病、香蕉枯萎病、棉花枯萎病、橡胶炭疽病、橡胶树棒孢霉落叶病、茶轮斑病、芒果炭疽病、和或橡胶褐根病中的一种或多种。

本发明提供的菌株，经多项分类鉴定，确定为解淀粉芽孢杆菌的一个新种，暂命名为解淀粉芽孢杆菌HAB-2(Bacillus amyloliquefaciens.HAB-2)，已于2015年1月27日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行了菌种保藏，并证明存活，其保藏登记号为：CCTCC M 2015070，地址为武汉大学内。