[发明专利]基于显微图像分析的稻瘟病菌孢子检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种稻瘟病菌孢子检测方法，尤其是一种基于显微图像分析的稻瘟病菌孢子检测方法，属于稻瘟病检测技术领域。

背景技术

选育和种植抗性品种是防控稻瘟病的有效措施，在稻瘟病室内抗性鉴定中，病菌悬浮液中孢子的数量是影响抗性鉴定结果的重要因素，当悬浮液中的孢子数量不符合接种要求时，将会错误地评估水稻品种的抗性等级；此外，稻瘟病的发生及病害的严重程度与一定区域内病菌(分生孢子)的数量密切相关。因此，研究快速、准确的稻瘟病菌孢子检测方法无论对稻瘟病的抗性鉴定还是田间病害监测都具有重要意义。

病菌的常用检测方法有平板菌落计数法、显微镜下人工计数法、比浊法和流式细胞仪测定法等。平板菌落计数法的成本低，但其劳动强度大、检测耗时长；显微镜下人工计数法适用于体积较大菌体的检测，对于个体较小的菌体操作工作量和误差较大；比浊法成本较高，适用于菌体分散良好且干扰少的细菌；流式细胞仪测定法检测速度快，精度高，但设备仪器昂贵。

目前，在植物病菌孢子检测方面，通常是操作人员根据显微镜下病菌孢子的形态特征完成检测和计数，由于显微图像中孢子个体小、数量大、杂质多，利用人工计数方法费时费力，且易造成较大计数误差。因此，为了提高稻瘟病菌孢子检测的准确率和自动化水平，需要研究＝一种简便、准确、高效的孢子检测和计数方法。

虽然显微图像处理技术检测稻瘟病菌的研究未见报道，但是已有一些学者利用显微图像技术检测其他植物病原菌的研究：1)Chesmore等(Chesmore D，Bernard T，Inman A J，et al..Image analysis for the identification of the quarantine pest Tilletia indica[J].EPPO Bulletin，2003，33(3)：495-499.)利用病害图像研究小麦印度腥黑穗病孢子和黑麦草腥黑穗病菌孢子的分类，该研究从病害图像中自动定位孢子，并提取其周长、表面积、突起数及突起的大小、最大(小)半径和圆形度等相关参数作为分类依据；2)张俊祥等(张俊祥，肖茜，方呈祥，等.噬菌斑电子图像的计算机处理及其自动计数[J].中国病毒学，2003，18(4)：387-390.)将噬菌斑制成电子图像，抽取图像中有代表性的区域，利用分水岭算法对图像进行分割处理，将相连的噬菌斑分割成单独的噬菌斑，然后利用区域生长法进行计数；3)张荣标等(张荣标，黄义振，孙晓军，等.基于图像处理的圆褐固氮菌浓度快速检测方法[J].农业机械学报，2012，43(10)：174-178.)通过对圆褐固氮菌微视图像的采集、预处理、分割和特征提取，运用SVM进行识别、分类和计数，获取圆褐固氮菌的浓度，实现了圆褐固氮菌活性的快速检测；4)邓继忠等(邓继忠，李敏，袁之报，等.基于图像识别的小麦腥黑穗病害特征提取与分类[J].农业工程学报，2012(03)：172-176.)利用小麦腥黑穗病害显微图像，采用图像分析与识别技术进行了小麦的矮腥、印度腥及网腥3类病害的分类识别。通过分析，从病害孢子图像的16个形状和纹理特征中，选择长轴、短轴、等价椭圆短轴、周长、面积和熵6个典型特征用于分类，并基于线性核函数建立支持向量机模型，对这3种小麦腥穗病害进行分类鉴定，总体识别率达到82.9％；5)李小龙等(李小龙，马占鸿，孙振宇，等.基于图像处理的小麦条锈病菌夏孢子模拟捕捉的自动计数[J].农业工程学报，2013(2)：199-206.)利用孢子捕捉器捕捉小麦条锈病菌夏孢子，运用显微镜照相技术获得孢子图像，对图像进行基于最近邻插值法的缩放处理、基于K-means聚类算法的分割处理、形态学操作修饰和分水岭分割等一系列的处理，实现夏孢子的自动计数和标记。

通常稻瘟病菌孢子在显微镜下人工计数时，放大倍数为10×10，此时，孢子中间部位透明，只含有边界信息，而有时边界信息并不清晰，给图像处理带来很大困难。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述现有技术的缺陷，提供了一种基于显微图像分析的稻瘟病菌孢子检测方法，该方法能实现稻瘟病菌孢子数量的快速、准确的自动检测，可为稻瘟病室内抗性鉴定过程提供技术支持。

本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：

基于显微图像分析的稻瘟病菌孢子检测方法，所述方法包括：制备孢子悬浮液；利用稻瘟病菌孢子图像检测系统获取孢子悬浮液中的孢子显微图像；然后利用图像光照校正、中值滤波、边缘检测、形态学运算对孢子显微图像进行处理，并结合形状特征参数，提取出只含孢子的显微图像；最后采用改进分水岭算法对粘连孢子进行分离，进而实现显微图像中孢子的检测和数量统计。