[发明专利]猪瘟病毒检测引物对的用途及检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及用于猪瘟病毒巢式RT-PCR检测的引物对的用途以及试剂盒。

背景技术

猪瘟病毒(Hogcholera virus，Swine fever virus)是猪瘟的病原，危害猪和野猪。猪瘟是一种急性、热性、高度接触性传染病，主要特征是高温、微血管变性而引起全身出血、坏死、梗塞。猪瘟对猪危害极为严重，会造成养猪业重大损失。

关于猪瘟检测，2007年，朱小甫等参照GenBank上发表的猪瘟病毒Shimen株基因序列，设计并合成引物对，其中扩增采用的引物在E2基因内，建立了猪瘟病毒的PCR检测方法(朱小甫等2007)。然而该方法建立在具有很大变异性的E2基因内，因而，敏感性和特异性比较差。

另外，国标GB/T 16551 2008中也存在关于猪瘟病毒反转录聚合酶链式反应方法。然而该国标中需要得到1200nt大小的基因片段。通常情况下，1000nt以上大小的基因片段，会存在一些问题，例如，与较短基因片段相比，使用较多的试剂，并且耗时。另外，更为重要的是在扩增时容易产生较多的噪音，从而影响检测结果的准确性或可靠性。

综上所述，目前仍然存在以更高的敏感性、特异性以及更高的准确性和可靠性检测猪瘟病毒的需求。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的发明人经过深入研究，发现通过设计针对猪瘟病毒(CSFV，HEBZ(登录号：GU592790))序列相对保守区(即，P7蛋白)的引物对，并通过巢式RT-PCR扩增得到较小目标基因片段，能够建立一种猪瘟病毒的RT-PCR快速检测方法，与现有PCR检测方法相比，具有了更好的敏感性、特异性以及准确性和可靠性。

具体地，一方面，本申请提供第一组引物对和第二组引物对在制备通过巢式RT-PCR检测猪瘟的检测剂中的用途，其中

所述第一组引物对为：

PF1为上游引物，其序列为CGCCACTCAGATTACTTC

PR1为下游引物，其序列为TTCCATAACCAGCCCTTT；

所述第二组引物对为：

PF2为上游引物，其序列为GCATTGCTTATGGTTAG

PR2为下游引物，其序列为AAGTGGGCAGTATGAGG。

在另一方面，本申请提供一种猪瘟巢式RT-PCR检测试剂盒，其包括

第一组引物对PF1和PR1：

PF1为上游引物，其序列为CGCCACTCAGATTACTTC

PR1为下游引物，其序列为TTCCATAACCAGCCCTTT，和

第二组引物对PF2和PR2：

PF2为上游引物，其序列为GCATTGCTTATGGTTAG

PR2为下游引物，其序列为AAGTGGGCAGTATGAGG。

本申请通过运用RT-PCR方法，在对猪瘟病毒的深入了解的基础上，建立了一种新的猪瘟巢式RT-PCR检测方法，并对其进行了优化，该方法是一种快速、灵敏、便捷的检测猪瘟病毒的分子生物学方法，与其他检测方法相比较，具有检出率高、特异性强的优点，适合大面积的猪瘟病毒检测。本方法可实现对CSFV的大规模流行病学调查、隐性感染的检测及临床诊断，同时，由于巢式RT-PCR检测方法的高敏感性，可以作为CSFV感染早期诊断的最好方法，从而大幅度提高在猪瘟病毒流行病学调查中的效率，避免由于敏感性低而造成的误诊，减少对中国养猪业造成的损失。该方法可在县级及其以上动物疫病预防控制中心进行推广和应用，也为进一步开展中国部分省区的猪瘟病毒流行现状调查工作奠定了基础。

通过解释以下本发明的优选实施方案，本发明的其他目的和优点将变得清楚。

附图说明

图1 为PCR检测猪瘟病毒结果。其中M：Marker DL2000；1-10为CSFV细胞毒PCR扩增结果；11为阴性对照。

图2 CSFV RT-PCR野毒检测方法特异性试验结果。其中M为Marker DL2000；1为阳性对照；2为CSFV毒株；3为PRV病料；4为PRRSV病料；5为PCV-2病料；6为PPV病料；7为未接种CSFV的正常细胞培养液。

图3 CSFV RT-PCR检测方法灵敏度试验结果。其中M：DL2000DNA分子标准；1～6依次为10⁶～10¹拷贝/μL梯度稀释PCR结果。

图4 部分病料中CSFV野毒的检测结果。其中M.DL2000DNA分子标准；1～24为部分病料PCR检测结果。