[发明专利]一种基于真菌微生物快速破壁及其裂解物可用于基因扩增的方法

说明书

技术领域

 本发明属于真菌微生物总DNA提取及其相关基因扩增技术领域，涉及一种真菌微生物的快速破壁及其裂解物可用于基因扩增的方法。

背景技术

     真菌微生物是存在于自然中极其重要的生物及其基因产物与人类生活紧密相关，因此，挖掘相关基因为人类服务是很有意义的工作。

    为了发掘真菌微生物基因就要提取总DNA，一般采用CTAB法、SDS法和试剂盒等方法提取真菌微生物总DNA，但耗时又费力，同时总DNA质量和产量一般都不高，反复冻融总DNA容易断裂，因此，真菌微生物的某些基因不能获得有效扩增。

     菌液和菌落PCR是不需要提取总DNA的基因扩增方法，但该方法常见于细菌微生物，主要在PCR反应中的94℃、5-10min预变性条件下裂解细胞，而在此条件之下真菌微生物细胞壁较难破碎，因此，不能采用菌液和菌落PCR方法直接扩增真菌微生物基因。

发明内容

    为了克服现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种基于真菌微生物快速破壁及其裂解物可用于基因扩增的方法，对比其它真菌微生物提取方法，本发明方法简便快捷、特异性高、通用性好，特别适用于青霉属、曲霉属、木霉属等真菌微生物快速破壁，准确地扩增这些微生物的相关基因。

     本发明提出一种真菌微生物快速破壁的方法,其特征在于将处理好的真菌微生物运用基因扩增仪通过以下程序快速破壁：

2-6℃，10-30分钟；

35-39℃，10-30分钟；

93-97℃，10-20分钟；

将真菌微生物裂解物作为基因扩增模板。

一种基于真菌微生物快速破壁的裂解物可用于基因扩增的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1）真菌微生物收集；

2）用真菌微生物裂解物，取0.1-1.0μL裂解物作为模板进行PCR反应，获取基因产物；所述PCR反应参数包括：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸60s，30 个循环；72℃延伸10min ；

3）通过特异性引物扩增真菌微生物基因，采用电泳检测所述扩增产物。

所述试剂盒包括：0.2-1.0μM 上游引物；0.2-1.0μM 下游引物；0.05-1U/μL Taq DNA 聚合酶混合缓冲液， 20μM Tris-HCL，pH8.3，100μM KCL，3-4μM MgCL₂ ；灭菌双蒸水。

   所述 Taq DNA 聚合酶混合缓冲液包括TaqDNA 聚合酶、dATP、dTTP、dCTP 及dGTP 各400-500μM。

    本发明在上述真菌微生物破壁及其裂解物相关基因扩增的整个过程中，平均只需2-3h，使得DNA总提取及其相关基因扩增的时间大大缩短，提高了效率。

     综上所述，本发明提供了真菌微生物的快速破壁及其裂解物可用于基因扩增的方法，为真菌微生物相关基因扩增提供了快捷适用的技术。本发明可用于青霉属、曲霉属、木霉属等真菌微生物的快速破壁及其裂解物可用于相关基因的扩增。

附图说明

      图1 为PCR 产物电泳结果：1. 黑曲霉，2. 青霉菌，3. 里氏木霉，M. 标准DNA 分子量。

具体实施方式

通过以下具体实施例和附图，对本发明作详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除本领域的普遍知识和公知常识外，本发明没有特别限制内容。

        1、真菌微生物收集

      将保藏的黑曲霉、青霉菌、里氏木霉等真菌微生物接种到装有25mL的PDA培养基中，于28℃、200rpm培养48h，于4℃12000rpm收集细胞沉淀，弃上清，用灭菌去离子水洗涤两遍，待用。

        2、真菌微生物的快速破壁及其PCR模板的提取

       将装有25μL细胞沉淀于4℃用移液枪头上下击打5min，再于PCR管中加入100μL的4℃灭菌去离子水，运用基因扩增仪通过以下程序快速破壁：

        4℃，10-30分钟

         37℃，10-30分钟

       95℃，10-20分钟

       将上述0.5-1.0μL真菌微生物裂解物作为基因扩增模板。