[发明专利]一种山羊冻精稀释液及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是动物人工受精的技术领域，尤其涉及的是一种山羊冻精稀释液及其制备方法。

背景技术

市场上的山羊冻精稀释液配方中均采用添加卵黄作为冻精保护液，如中国专利文献ZL201210446934.9，公开了一种波杂山羊冻精稀释液，包括糖类、柠檬酸、乙二胺四乙酸、Tris和卵黄。在山羊冻精稀释液中，卵黄的作用是为了补充冻精过程中细胞膜上磷脂和胆固醇的丢失，是山羊冻精稀释液中的关键配方，但卵黄具有多方面的缺陷，主要包括：1)卵黄中含有较多的微生物，使得稀释液更容易受到污染，从而导致内毒素的产生，降低精子的授精能力，而且也会导致疾病的传播；2)卵黄的添加一般来源于鸡蛋的蛋黄，但是每个蛋黄中卵黄的含量都存在较大差异，导致卵黄成分含量变动较大，所以很难配制成标准的稀释液配方；3)山羊精液中常含有来源于尿道球腺的卵黄凝固酶，它会与卵黄作用生成毒性物质对精子产生损伤。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种山羊冻精稀释液，以提供一种不含有卵黄的山羊冻精稀释液。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种山羊冻精稀释液，主要成分为14～18g/L的磷脂酰胆碱和2～6g/L的胆固醇。

优选地，所述冻精稀释液的成分包括：

进一步优选地，所述冻精稀释液的成分包括：

所述冻精稀释液还包括体积比为5％的甘油。

一种上述山羊冻精稀释液的制备方法，包括以下步骤：

(1)按照配比准确称取Tris、果糖、柠檬酸、甘油、青霉素、链霉素，溶解并混合，过滤，获得混合液；

(2)按照配比准确称取磷脂酰胆碱和胆固醇，加入步骤(1)的混合液中，超声混匀，获得所述冻精稀释液；

优选地，所述步骤(1)中，过滤的滤膜孔径为0.22μm。

本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种山羊冻精稀释液，该冻精稀释液中利用磷脂酰胆碱和胆固醇来取代卵黄，用于补充冻精过程中细胞膜上磷脂和胆固醇的丢失，具有保护精子的作用，其冻精保护效果优于传统的卵黄，同时，避免了山羊精液中携带的少量卵黄凝固酶与卵黄作用造成的对精子的损伤，以及由卵黄带来的其它不利影响。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

本实施例的一种山羊冻精稀释液的制备方法，包括以下步骤：

(1)用电子天平准确称取3.070g的Tris、1.260g果糖、1.640g柠檬酸、100000IU的青霉素和0.100g的链霉素，置于烧杯中，再用注射器取5mL甘油加入该烧杯中，加入双蒸水定容至100mL，在超净工作台上使用0.22μm的过滤器进行过滤，获得混合液；

(2)用电子天平准确称取1.600g磷脂酰胆碱和0.400g胆固醇，加入步骤(1)的混合液中，再置于超声波均质器中超声震荡10min，用注射器分装至15mL的离心管中，封口，获得所述冻精稀释液。

取山羊精液，将其与上述获得的冻精稀释液按照1：4体积比混合，液氮冷冻备用；同时，用卵黄代替上述冻精稀释液配方中的磷脂酰胆碱和胆固醇，获得卵黄冻精稀释液，将山羊精液与卵黄冻精稀释液按照1：4体积比混合，液氮冷冻备用；

将上述液氮冷冻的含有山羊精液的冻精稀释液和卵黄冻精稀释液置于42℃下水浴解冻，分别测定山羊精液冻精解冻活力，质膜完整率和顶体完整率，具体步骤包括：

A、活力的测定：

100倍显微镜下，在37℃热台上进行检测，取5ul的待测解冻后的精液滴于玻片上，盖上盖玻片在显微镜上进行检测；每份精子活力在三个不同视野中进行评估，三个连续评估值的平均值作为最后的精子活力值，计算公式如下：

精子活力＝(直线前向运动精子数/精子总数)×100％；

B、质膜完整率的测定：