[发明专利]用于提供含佐剂病毒体的方法及由此可获得的含佐剂病毒体

说明书

本发明涉及免疫学和疫苗学的领域。提供了用于制备含佐剂病毒体的方法，包括以下步骤：(i)提供包含膜融合蛋白的非含佐剂病毒体的水性组合物；(ii)将两亲性佐剂溶解于可以与水形成均匀混合物的药用非水溶剂；以及(iii)在所述水性病毒体组合物中稀释所述佐剂溶液以诱导在病毒体膜的外小叶中插入佐剂，同时保持病毒体的膜融合活性。还提供了通过所述方法可获得的含佐剂病毒体，以及包含该病毒体的疫苗。

背景技术

本发明涉及免疫学和疫苗学的领域。具体地，本发明涉及用于提供病毒体的改善方法、包含病毒体的组合物以及其应用。对抗含膜(包膜)病毒的疫苗主要由灭活的或活减毒的病毒，或它们的蛋白质的制剂(例如，裂解病毒疫苗或亚单位制剂)组成。使用灭活的病毒和蛋白制剂的接种疫苗是比使用复制活减毒或重组病毒的接种疫苗更安全的，因为后者可能突变或恢复到野生型病毒。亚单位疫苗导致更少的局部和全身副作用并且具有以下明显优势：它们可以制备自由细胞表达的重组病毒蛋白而不是制备自病毒，使得生产更安全并消除活病毒污染疫苗制剂的风险。然而，虽然活病毒的注射一般诱导较强的细胞和抗体免疫应答，防止病毒的未来感染，非复制型疫苗如蛋白质制剂，尤其是膜蛋白制剂，可能不能如此，其主要诱导抗体应答。感染的细胞可以在它们的表面上的MHC-1分子上呈递来自感染病原体的物质，引发细胞免疫应答，如细胞毒性T细胞应答。不在细胞内产生的许多蛋白质制剂将不会以这种方式被呈递给免疫系统。活的或灭活的病毒还将优先被免疫系统的特异性吞噬细胞，如树突状细胞所吸收，并且呈递给免疫系统的其它细胞，触发免疫应答。这些吞噬细胞巡查身体，摄取病毒尺寸的颗粒，但它们不会有效地吸收纯化的蛋白质如来自裂解病毒或亚单位疫苗的那些。膜蛋白的具体问题在于它们不溶于水。因此，为了成功呈递给抗原呈递细胞，这些蛋白质需要某种形式的增溶，以允许它们用于疫苗。

已经通过物理或化学方式进行了许多尝试来增强对亚单位或蛋白质制剂的免疫应答。从这些实验中出现的最重要的原则是，在将由吞噬细胞有效地吸收的颗粒中需要结合病毒蛋白的多个拷贝。这些颗粒可以是病毒体样颗粒、病毒体、免疫刺激复合物(ISCOM)、混合微团(mixed micelle)、蛋白体制剂或微粒载体上的蛋白质。经常地，这些颗粒还含有化学物质(称为佐剂)，其意在刺激针对免疫系统的吞噬细胞或效应细胞上的特异性受体的免疫系统。

病毒体是一种特别有用的疫苗成分。病毒体是有包膜病毒的重组的膜。它们通常通过用去污剂或短链磷脂从有包膜病毒提取膜蛋白和脂质，随后从提取的脂质和病毒膜蛋白除去该去污剂或短链磷脂来产生，事实上重组或重整环绕病毒核或核衣壳的特征脂质双层(包膜)(WO2004/071492,Stegmann T.et al.,1987,EMBO J.6,2651-2659)。然而，病毒体可以基本组装自每种膜内在蛋白或外周膜蛋白、或结合于脂质锚定的蛋白。病毒体的基本特征在于，它们是由免疫系统的吞噬细胞有效地吸收的尺寸的颗粒，以及它们密切模仿天然病毒包膜的组成、表面结构和功能活性，尤其是膜融合活性。可以将其它分子如脂质、佐剂或蛋白质加入溶解的膜材料。然后通过除去去污剂或短链磷脂来重组膜，产生病毒体。在膜重组期间，添加的分子将包含在病毒体内或整合在病毒体膜中。病毒体可以用作疫苗或用来将分子递送进入细胞。

流感病毒和塞姆利基森林病毒(SFV)是包膜病毒的两种典型实例。包膜病毒一般携带特异性膜蛋白(“刺突”)，其是结合和进入细胞所需要的。这些蛋白质以亚稳态构象，称为“融合前形式”，存在于成熟病毒体的表面上。在病毒与细胞的结合以后，由这些病毒感染细胞的第一步骤是由受体介导的内吞作用来吸收完整的病毒颗粒。然后由于在内涵体的膜中存在的ATP依赖性质子泵的活跃，内涵体小室变成弱酸性。由这些酸性条件(pH 5-6)的触发，病毒刺突蛋白经历构象变化(从“融合前”到“融合后”构象)，其驱动病毒膜与内涵体的膜的融合。作为这样的融合的结果，病毒核衣壳和遗传物质(DNA或RNA)进入细胞质，且基因组复制产生子代病毒。