[发明专利]乙酰化类鞘氨醇碱的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生产乙酰化类鞘氨醇碱的Starmerella属的修饰微生物以及使用该微生物的乙酰化类鞘氨醇碱的制备方法。

背景技术

鞘脂通过始自L-丝氨酸和脂肪酰辅酶A例如棕榈酰辅酶A之间的缩合反应的生物合成获得。鞘脂的基本结构，即，类鞘氨醇碱，其主要以链长为18个碳原子的分子合成，并且已知为，例如鞘氨醇、植物鞘氨醇、二氢鞘氨醇(二氢神经鞘氨醇sphinganine)、和6-羟基鞘氨醇。

鞘脂具有许多生理学功能。特别是神经酰胺和类鞘氨醇碱，其参与了皮肤保湿功能和皮肤屏障功能，抑制了水分从皮肤的蒸发并且在保护人体免于多种外部刺激中起作用。植物鞘氨醇被报道为针对金黄色葡萄球菌(Staphyrococcusaureus)、化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)、藤黄微球菌(Micrococcusluteus)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)、白色念珠菌(Candidaalbicans)和须毛癣菌(Trichophytonmentagrophytes)具有生长抑制作用(非专利文献1和2)。具体而言，植物鞘氨醇在痤疮丙酸杆菌上的抗菌作用高于红霉素的，所述红霉素是一种大环内酯类抗生素(非专利文献3)。

已知通过外部敷用提供神经酰胺或类鞘氨醇碱显示出改善皮肤性质的作用。进而，已经证实，当向皮肤敷用植物鞘氨醇和乙酰化植物鞘氨醇的四乙酰基植物鞘氨醇时，其渗透进入皮肤并且转变为神经酰胺(专利文献1)。因此，外部敷用的神经酰胺、类鞘氨醇碱或乙酰化植物鞘氨醇预期具有对皮肤性质的改善作用以及针对造成感染的微生物的生长抑制作用。

近来，已经创立了用于对皮肤的神经酰胺构成进行具体分析的技术，并且已经发现有12类(340种或更多种)由脂肪酸和类鞘氨醇碱的组合形成的神经酰胺分子类型(非专利文献4)。例如，发现了由饱和脂肪酸和植物鞘氨醇的组合、链长为23-30个碳原子的脂肪酸和链长为16-26个碳原子的植物鞘氨醇的组合形成的神经酰胺NP，并且已知存在具有脂肪酸中的链长总计为40-52个碳原子和植物鞘氨醇的分子。作为由饱和脂肪酸和鞘氨醇的组合形成的神经酰胺NS，发现了链长为16-30个碳原子的脂肪酸和链长为16-26个碳原子的鞘氨醇的组合，并且已知存在具有脂肪酸中的链长总计为40-54个碳原子和鞘氨醇的分子(非专利文献4)。已知健康皮肤包含大量的长链神经酰胺；反之粗糙皮肤中的神经酰胺的含量较低，另外短链神经酰胺的量增加(非专利文献5)。由此，长链神经酰胺或者类鞘氨醇碱的利用性可以预期。

但是，目前市面可得的神经酰胺、类鞘氨醇碱和乙酰化植物鞘氨醇极其昂贵，例如每kg几十万日元。另外，它们的碳链长度受到限制。例如，对于神经酰胺NP和神经酰胺NS，仅可得到具有34、36或40个碳原子的分子；对于植物鞘氨醇和鞘氨醇，仅可得到具有18个碳原子的分子。

由于难以将源自动物或植物的鞘脂进行分离和提纯，近来已经开发出通过酵母发酵制备鞘脂的方法来作为制备神经酰胺和类鞘氨醇碱的方法。备选的酵母菌株包括毕赤酵母(pichiaciferrii)；目前的Wickerhamomyces酵母、产蛋白假丝酵母(Candidautilis)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，并且已经积极地开发出使用Wickerhamomyces酵母得到四乙酰基植物鞘氨醇的方法，其使四乙酰基植物鞘氨醇从酵母细胞中分泌(secrets)出来(专利文献6)。通过这样的方法制备的乙酰化植物鞘氨醇主要为18个碳原子的。将乙酰化植物鞘氨醇脱乙酰化并用作植物鞘氨醇，或者通过酰胺键通过化学合成键合到脂肪酸上并用作神经酰胺。

由生物合成途径的体外分析已经阐明，在Wickerhamomyces酵母中四乙酰基植物鞘氨醇合成的限速步骤是丝氨酸与棕榈酰辅酶A的缩合反应以及植物鞘氨醇的乙酰化反应。另外，发现了两种用于植物鞘氨醇的乙酰化酶，SLI1和ATF2(非专利文献7)。在它们之中，当SLI1在酿酒酵母中表达时其产生三乙酰基植物鞘氨醇(非专利文献6)。由此认为，SLI1参与了植物鞘氨醇3个羟基的任何三个位点和单一氨基的乙酰化。

另一方面，Starmerella属的微生物例如Starmerellabombicola(旧学名：Candidabombicola)已知能够在细胞外产生大量作为糖脂质的生物表面活性剂，，并且为具有高脂质利用性的微生物(非专利文献8)。但是，关于该微生物是否产生神经酰胺或者鞘脂知之甚少。