[发明专利]检测遗传变体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及遗传变体的检测，包括用于检测遗传变体的方法和试剂盒。

背景技术

群体中个体之间的遗传变异通常通过在一些情况下表现为疾病或障碍的表型改变而观察。有些情况下，疾病或障碍仅表现为对外部刺激诸如药物或其他化学品的不良反应。通过遗传检测进行药物不良反应(ADR)与患者遗传组成的关联研究有希望大大降低与ADR相关的发病率和死亡率。在ADR与遗传变体之间存在若干已知的联系。

氟尿嘧啶(5-FU)已被用作治疗乳腺癌、结直肠癌、肺癌和其他癌症患者的化疗剂达数十年。5-FU的副作用包括腹泻、口腔炎、粘膜炎、神经毒性，并在一些情况下，包括死亡。这些副作用主要是因为在遗传学上不能代谢该药物。二氢嘧啶脱氢酶(DPD)(一种由DPD基因编码的酶)负责消除约80％标准剂量的5-FU。由于DPD基因突变导致的DPD缺乏已与严重的5-FU毒性相关联。已发现，约3-5％的患者具有至少部分DPD缺乏。与DPD缺乏相关的最常见突变是IVS14+1G>A，其为在内含子14(称为DPD*2A)的剪接识别序列处发生的G>A碱基改变。该单核苷酸变异导致外显子跳读，并在DPDmRNA中产生165-bp的缺失。纯合子DPD*2A基因型导致完全缺乏，而杂合的DPD*2A基因型导致DPD的部分缺乏。该代谢功能障碍的治疗前检测可通过施用替代性处理而预防严重的5-FU副作用。

类似地，已报道了在用氯吡格雷治疗的急性冠状动脉综合征(ACS)患者尤其是接受经皮冠状动脉介入(PCI)的那些患者之中CYP2G19基因型与临床预后的联系。氯吡格雷是一种经常出现在处方中的口服抗血小板剂，其用于在冠状动脉疾病、外周血管疾病和脑血管疾病中抑制血块。作为噻吩并吡啶前药，氯吡格雷需要肝脏生物转化以形成活性代谢物。肝CYP2C19酶是在参与氯吡格雷代谢的CYP450超家族中的一种酶。CYP2C19基因是高度多态性的，具有超过25种已知的变体等位基因。最常见的CYP2C19功能丧失性等位基因是CYP2C19*2(c.681G>A；rs4244285)，等位基因频率在高加索人和非洲人中为约15％，在亚洲人中为29-35％。然而，当前针对功能丧失的遗传检测方法通常需要昂贵的仪器和长周转时间。

另一个实例是发现卡马西平引起的斯-琼综合征/中毒性表皮坏死松解症(SJS/TEN)与人白细胞抗原(HLA)特定等位基因HLA-B*1502的密切联系。卡马西平是用于治疗患有癫痫、神经性疼痛和双相情感障碍的一线药物。然而，卡马西平治疗可导致危险的或甚至致命性的皮肤反应，诸如在具有HLA-B*1502等位变异的患者中的SJS和TEN。HLA-B*1502等位基因在亚洲人群(日本人和韩国人除外)中的出现率远高于在高加索人和非洲人群中的出现率。一些研究揭示：对卡马西平引起的SJS进行的HLA-B*1502检测的阴性预测值可接近100％。HLA-B基因是高度多态性的，具有超过2000个独特的等位基因，这使得特定等位基因的测定复杂化。Sanger测序被视为HLA分型的金标准。然而，相位多值性(ambiguity)在等位基因组合的鉴定中经常导致SBT存在问题。下一代测序(NGS)技术能够获得单个DNA分子的序列，并可排除相位多值性，但当前NGS方法的缺点包括读取长度短、文库制备工作量高和处理时间长。最近的报道将环介导等温扩增(LAMP)用于HLA-B*1502筛查(Cheng,etal.Clin.Chem.2009,55,1568.)。遗憾的是，这些方法的特异性不足以将HLA-B*1502与相当多的在一些群体中不稀有的其他等位基因区分开来。错误的测定会将SJS风险极低的患者从有效的卡马西平疗法中排除，并增加治疗成本。由于HLA-B*1502筛查的成本效益高度依赖于遗传检测的准确性和成本，因此迫切需要特异性更高且成本更低的新测定法。

美国食品药品监督管理局(FDA)和其他监管机构已要求对若干在某些基因型中可能具有副作用的药物在标签上注明。例如，对基于氟尿嘧啶(5-FU)的药物的要求是要包括在一些个体中发生超敏反应的警告。又如，美国食品药品监督管理局在2007年发出警示：建议在用卡马西平开始治疗其祖先来自存在特定等位基因的地区的患者之前对HLA-B*1502等位基因进行筛查。类似地，卡马西平标签上的黑框警告建议在具有ACS或PCI的弱代谢者中考虑使用替代抗血小板疗法。