[发明专利]测量干血斑中无细胞病毒颗粒的方法

说明书

描述了测量干血斑中游离核酸和/或病毒颗粒的方法。所述方法可包括以下步骤：再水化干血样、任选地将存在于所述再水化的干血样中的细胞固定、将游离病毒颗粒从所述再水化的干血样中洗脱、使用过滤器将所述游离病毒从可能存在于所述再水化的干血样中的任何细胞残渣上分离以及通过病毒颗粒定量技术测量游离病毒颗粒。

发明领域

本发明涉及测量血液中病毒载量的领域，并且更具体地讲，涉及测量干血斑中无细胞病毒颗粒的方法。

发明背景

2013年，世界卫生组织（WHO）修订了现行的HIV治疗和预防准则并强调了HIV病毒载量（VL）测试在对HIV阳性患者的管理中的重要性。WHO强烈推荐使用HIV病毒载量测试替代临床表现和CD4细胞计数以监测HIV抗逆转录病毒疗法（ART），并且将对于治疗效果的HIV血浆VL水平的截断值从5000份拷贝/mL降至1000份拷贝/mL。换句话讲，如果接受ART治疗的HIV患者血浆中的病毒滴度大于1000份拷贝/mL，则将看作是药物治疗失败。对治疗失败的应对（如依从性咨询、药物耐药性测试和二线治疗方案）是耗时且昂贵的，而应当仅在有必要时使用。

在感染后，HIV病毒不仅在被感染的细胞内开始自我复制，还将其cDNA整合至宿主染色体中作为潜伏的HIV前病毒DNA（Greene, W.C. 与 Peterlin, B.M., 2002, ChartingHIV’s remarkable voyage through the cell, Nat Med.8(7): 673-80; Blankson,J.N., D. Persaud, R.F.Siliciano, 2002, The Challenge of Viral Reservoirs inHIV-1 Infection, Annu.Rev. Med.53:557-593）。通常使用血浆作为标本类型测量HIV病毒载量。然而，在资源有限的环境中，如非洲，血浆样品可能不易获得、保存、转移和测试（世界卫生组织 2013，关于使用抗逆转录病毒药物治疗和预防HIV感染的综合准则：对公共卫生措施的建议。世界卫生组织，日内瓦）。已经就干血斑（DBS）作为在资源有限的环境中HIV病毒载量测试的解决方案进行了评价，但取得了有限的成功（Smit PW 等人， 2014,Systematic review of the use of dried blood spots for monitoring HIV viralload and for early infant diagnosis, PLoS ONE.9(3): e86461; Bertagnolio, S.,N.T.Parkin, M. Jordan, J. Brooks, J.G.Garcia-Lerma, 2010; Dried blood spotsfor HIV-1 Drug Resistance and Viral Load Testing: A Review of CurrentKnowledge and WHO Efforts for Global HIV Drug Resistance Surveillance, AIDSRev. 12:195-208; Johannessen, A, 2010; Dried blood spots in HIV monitoring:applications in resource-limited settings, Bioanalysis.2(11):1893-1908）。RocheMolecular Diagnostics（RMD）于2009年开发了一款仅研究使用（RUO）的产品，其使用实时PCR COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® (CAP/CTM) HIV-1 测试 v2.0和干燥液斑法（DFSP）以测量DBS中的HIV病毒载量。遗憾的是，当测试成对的血浆和DBS样品时，相比血浆金标准，DFSP测试得到了更高的病毒载量滴度。这一过高估计在具有血浆病毒载量小于5,000份拷贝/mL的样品中尤为明显，据推测是由于检测到了与细胞结合的HIV DNA和RNA。