[发明专利]尿液中的HPV检测

说明书

本公开内容领域

本公开内容涉及基于分子技术的医学和临床诊断的领域。该技术包括用于检测来 自人受试者的尿液样品中人乳头瘤病毒(HPV)核酸分子作为受试者中HPV感染的指示物的 方法。该检测方法包括HPV感染的类型特异性检测和HPV基因型的检测。

本公开内容的背景

就在最近的2011年，通过使用尿液样品的人乳头瘤病毒(HPV)感染的检测包括了 对可溶性PCR抑制剂在尿液中存在的关注(参见Bissett等的第1745页右栏)。该关注导致 Bissett等测试了三种不同的用于处理尿液样品的方案作为HPV核酸提取的一部分。被报道 为在三种当中具有较好的灵敏度的一个方案是，以13,000rpm离心尿液(1ml)20分钟，去除 所得的上清液，在300μl中重悬，然后在-25℃冷冻直到用于核酸提取。其他两种方案是，在- 25℃储存未处理的尿液，随着i)在解冻之后离心和重悬(并然后立即用于核酸提取)；以及 ii)在解冻之后不处理(并直接用于核酸提取)。

相比于未分级的尿液，Bissett等报道的细胞团块(cellularpellet)中的较高灵 敏度与多名研究人员如Vorsters等在2012年以及Enerly等在2013年综述的使用细胞团块 一致。Vorsters等指出的两个例外是，Strauss等，其等报道了通过离心为上清液和重悬在 较小体积上清液中的细胞团块对尿液分级，以及Smits等，其报道了如由Boom等所描述的通 过硫氰酸胍(guanidiniumthiocianate)裂解和分离来提取男性尿液。使用稀释减少或消 除PCR抑制剂的影响被Strauss等明确指出(参见第538页)。Strauss等还报道了通过浓缩细 胞团块通过用尿液上清液重悬形成的级分(fraction)中58.4％的峰值灵敏度(参见第540 页)。

本文对文献的引用不应被解释为反映对任一文献是相关的现有技术的承认。此 外，它们的引用不指示对相关公开内容的检索。关于这些文献的日期或内容的所有叙述基 于可获得的信息而不是对其准确性或正确性的承认。

本公开内容简述

本公开内容涉及用于检测来自人受试者的尿液样品中的人乳头瘤病毒(HPV)核酸 分子的方法。所公开的方法不将尿液分级为无细胞级分和含细胞级分，或可溶性级分和不 溶性级分，并且令人惊讶地提供了比对于细胞团块报道的灵敏度更高的灵敏度。不分级允 许从尿液制备核酸而不产生因分离技术导致的分子损失。甚至在制备和检测HPV核酸之前 解冻的冷冻样品的情况下观察到来自未分级的尿液的令人惊讶的灵敏度。

在第一方面，本公开内容包括通过使用来自人受试者的尿液样品检测人乳头瘤病 毒(HPV)感染的方法。样品可来自女性或男性受试者，任选地调整所述检测以适应所观察到 的HPV感染的类型或者本领域技术人员已知的针对女性受试者或男性受试者的HPV感染的 类型。

所公开的方法包括从收集自人受试者的尿液样品中分离或制备核酸。尿液样品在 分离或制备之前是未分级的。因此，不存在将尿液样品处理为含细胞级分和无细胞级分，或 可溶性级分和不溶性级分。且尿液样品包含如人类受试者的尿液中存在的无细胞HPV核酸、 HPV病毒粒子或病毒颗粒，以及细胞缔合的HPV核酸。

在一些实施方案中，尿液样品被处理以减少核酸降解。处理可在收集之后且在样 品被进一步处理、操作或储存之前。在其他实施方案中，处理可在收集以及进一步处理、操 作或储存之后但在提取、分离或制备样品中的核酸分子之前。处理的非限制性实例包括冷 冻样品、降低样品的温度、热灭活样品中的核酸酶、增加pH、添加减少降解的试剂，或本领域 技术人员已知的这些技术的组合。在某些情况下，所添加的试剂增加pH、增加盐浓度或离子 强度；或者所添加的试剂是乙二胺四乙酸(EDTA)，盐酸胍异硫氰酸胍(GITC)或其他离液盐， N-月桂酰肌氨酸，以及十二烷基硫酸钠。如本文描述的任何处理产生被处理的尿液样品，从 该被处理的尿液样品可如下所述地制备核酸。

HPV核酸的分离或制备在外源或添加的核酸载体试剂的存在下来进行。载体试剂 可以是技术人员已知的用于改进核酸的分离而不干扰随后的分离步骤的任何载体试剂。非 限制性实例包括载体RNA、载体DNA、线性聚丙烯酰胺(LPA)和糖原。