[发明专利]多重RNA向导的基因组工程

说明书

相关申请数据

本申请要求于2013年7月9日提交的美国临时专利申请号61/844,168的优先权，并 且将其全部内容通过引证合并于此用于所有目的。

政府利益的声明

本发明是根据能源部的DE-FG02-02ER63445、国家科学基金会的NSF-SynBERC以及 国家科学基金会的SA5283-11210的政府支持下完成的。政府对本发明具有一定的权利。

背景技术

细菌和古细菌CRISPR-Cas体系(system)凭借短的向导RNA形成Cas蛋白复合物以 指导存在于侵入的外来核酸内的互补序列的降解。参见Deltcheva，E.etal.CRISPRRNA maturationbytrans-encodedsmallRNAandhostfactorRNaseIII.Nature471， 602-607(2011)；Gasiunas,G，Barrangou,R.，Horvath,P.&Siksnys,V.Cas9-crRNA ribonucleoproteincomplexmediatesspecificDNAcleavageforadaptive immunityinbacteria.proceedingsoftheNationalAcademyofSciences109, E2579-2586(2012)；Jinek,M.etal.Aprogrammabledual-RNA-guidedDNA endonucleaseinadaptivebacterialimmunity.Science337,816-821(2012)； Sapranauskas,R.etal.TheStreptococcusthermophilusCRISPR/Cassystem providesimmunityinEscherichiacoli.Nucleicacidsresearch39,9275-9282 (2011)；以及Bhaya,D.,Davison,M.&Barrangou,R.CRISPR-Cassystemsinbacteriaand archaea:versatilesmallRNAsforadaptivedefenseandregulation.Annual reviewofgenetics45,273-297(2011)。最近化脓性链球菌(S.pyogenes)II型CRISPR体 系的体外重构(reconstitution)证实了融合至正常反式编码的tracrRNA(“反式激活的 CRISPRRNA”)的crRNA(“CRISPRRNA”)足以指导Cas9蛋白序列特异地切割匹配该crRNA的 靶DNA序列。表达与靶位点同源的gRNA导致Cas9募集(recruitment)和靶DNA的降解。参见 H.Deveauetal.,PhageresponsetoCRISPR-encodedresistanceinStreptococcus thermophilus.JournalofBacteriology190,1390(Feb,2008)。

发明内容

本公开内容的方面旨在使用一种或多种x向导RNA(核糖核酸)多重修饰在细胞中 的DNA以指导由细胞表达的具有核酸酶活性的酶，如具有核酸酶活性的DNA结合蛋白，至该 DNA(脱氧核糖核酸)上的靶位置(targetlocation)，其中，该酶剪切DNA并且使外源供体核 酸插入至该DNA中，如通过同源重组。本公开内容的方面包括在细胞上循环或者重复DNA修 饰步骤以生成在细胞内具有多重DNA修饰(modification)的细胞。修饰可以包括外源供体 核酸的插入。

通过引入编码多个RNA以及多个外源供体核酸的核酸至表达酶的细胞，如通过共 转化(co-transformation)，的单一步骤，可以实现将多重外源核酸插入，其中表达该RNA并 且其中在多个RNA中的每一个向导该酶至DNA的特定位点，该酶剪切DNA并且将多个外源核 酸中的一个插入至在此剪切位点处的DNA。根据这个方面，在单一循环中产生了在细胞中的 DNA的多种改变(alteration)或修饰。