[发明专利]多重RNA向导的基因组工程在审
| 申请号： | 201480048643.1 | 申请日： | 2014-07-08 |
| 公开（公告）号： | CN105518144A | 公开（公告）日： | 2016-04-20 |
| 发明（设计）人： | 乔治·M·丘奇;詹姆士·迪卡洛 | 申请（专利权）人： | 哈佛大学校长及研究员协会 |
| 主分类号： | C12N15/63 | 分类号： | C12N15/63;C12N15/10;C12N15/09 |
| 代理公司： | 北京康信知识产权代理有限责任公司 11240 | 代理人： | 张英;宫传芝 |
| 地址： | 美国马*** | 国省代码： | 美国;US |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 多重 rna 向导 基因组 工程 | ||
1.一种在表达酶的细胞中对靶DNA进行多重改变的方法，所述酶同与所述靶DNA互补的 RNA形成共定位复合物并以位点特异性方式切割所述靶DNA，所述方法包括：
(a)将编码与所述靶DNA互补的一种或多种RNA的第一外来核酸引入至所述细胞中，并 且所述第一外来核酸向导所述酶至所述靶DNA，其中所述一种或多种RNA和所述酶是用于所 述靶DNA的共定位复合物的成员，
将编码一种或多种供体核酸序列的第二外来核酸引入至所述细胞中，
其中，表达所述一种或多种RNA以及所述一种或多种供体核酸序列，
其中，所述一种或多种RNA和所述酶共定位至所述靶DNA，所述酶切割所述靶DNA并且将 所述供体核酸插入至所述靶DNA以在所述细胞中产生改变的DNA，以及
将步骤(a)重复多次以在所述细胞中对于所述DNA产生多重改变。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述酶是RNA向导的DNA结合蛋白。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述酶是Cas9。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞是真核细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞是酵母细胞、植物细胞或者动物细胞。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述RNA是约10个至约500个之间的核苷酸。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述RNA是约20个至约100个之间的核苷酸。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一种或多种RNA是向导RNA。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一种或多种RNA是tracrRNA-crRNA融合体。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述DNA是基因组DNA、线粒体DNA、病毒DNA、或外 源DNA。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，通过重组将所述一种或多种供体核酸序列插入。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，通过同源重组将所述一种或多种供体核酸序列 插入。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一种或多种RNA和所述一种或多种供体核酸 序列是存在于一种或多种质粒上。
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