[发明专利]涉及核酸-蛋白质复合物的组合物和方法

说明书

相关申请

本申请要求2013年7月10日提交的标题为“COMPOSITIONS ANDMETHODSRELATINGTONUCLEICACID-PROTEIN COMPLEXES”的美国临时申请号61/844,818的权益，其完整内容通 过引用并入本文。

联邦政府资助的研究

本发明是在美国国立卫生研究院授予的DC002281下由美国政府 资助进行的。美国政府具有本发明的某些权利。

发明背景

DNA已成为所选择的用于构建自组装纳米结构的支架。随着用于 这些结构的程序图形化的技术已取得进展，现在可能产生复杂的组装 体(LinkoandDietz,Curr.Opin.Biotechnol.24:555-561,2013)。为 了利用这些结构元件并将它们制成功能性纳米机器，常常需要在非常 特异的位点上掺入蛋白质(Niemeyer,TrendsinBiotech20:395-401, 2002)。遇到的阻碍是将目标蛋白质偶联于DNA的成功方法。常规 用于将蛋白质连接于寡核苷酸(寡聚物)的化学过程包括二硫键联和 硫醇-伯胺键联(CecconiC.等,Eur.Biophys.J.37(6):729-38,2008)； Halvorsen等,Nanotechnol.22:494005-494012,2011；Niemeyerand Sacca,Chem.Soc.Rev.40:5910-5921,2011)。虽然这些化学过程有 时是有效的，但它们与生物学中常见的官能团反应。因此当目标蛋白 质具有内源半胱氨酸时或当想要附接于特定的伯胺(除了N末端以外， 每个赖氨酸提供伯胺)时，不能使用这些技术。为了克服许多的这些 问题，研究小组已着手开发生物正交技术诸如无铜点击化学(Gordon 等，J.Am.Chem.Soc.134:9199-9208,2012)。虽然这些技术克服了 特异性和化学计量的问题，但它们遭受面向所有3种技术的问题。所 有这些技术需要在亚最佳的生理条件下进行反应。由于长期处于室温、 氧化/还原条件或高/低pH条件下，当利用许多在这些条件下不是非常 热稳定的并且具有聚集和/或从溶液沉淀出来的倾向的蛋白质进行作 用时这些化学过程开始失效。除了关于这些化学过程的障碍以外，必 需针对不同的蛋白质谨慎地改变条件，并且不存在选择性纯化出所需 产物的方法。

发明概述

本公开内容部分地提供用于将核酸缀合于蛋白质的新型和稳健的 方法，所述方法克服了现有技术的缺点。这些方法前置待对核酸(包 括寡核苷酸)和小(通常合成的)肽进行的化学过程。这样的核酸和 肽对于可用于进行本公开内容中涉及的某些化学过程的非生理条件通 常是更加耐受的。

本公开内容提供了两步法及其变型，其包括首先将核酸(例如， DNA)缀合于短的通常合成的肽，以形成核酸-肽缀合物，随后使用转 肽酶(例如，分选酶)反应将核酸-肽缀合物缀合于目标蛋白质。两步 法的至少一个有利方面是将蛋白质与不利的反应环境分离的能力，所 述不利的反应环境可能降低所述蛋白质的活性。通过该两步法，在第 一步骤中使用这些不利的反应条件，并在第二步骤中引入所述蛋白质。

因此，在一些情况下，本公开内容的方法包括将核酸(诸如寡核 苷酸)缀合于包含一个或多个连续的N-末端甘氨酸(G)残基的氨基 酸序列。在一些实施方案中，氨基酸序列包含3个连续的N末端甘氨 酸残基。氨基酸序列通常被包含在短肽(通常为合成肽)中。N-末端 GGG基序由本公开内容的方法中使用的分选酶识别。

氨基酸序列还可包含可用于纯化目的的额外氨基酸序列。这些氨 基酸序列在本文中可被称为纯化标签或亲和标记，并且包括但不限于 His-标签和Flag序列(或Flag标签)，其氨基酸序列在本领域中是 已知的并且提供于本文中。

寡核苷酸至肽的缀合可使用例如生物正交铜催化点击化学反应来 实现。待缀合于肽的寡核苷酸可包含叠氮化物。叠氮化物可位于3'末 端或5'末端，或者它可以是内部的叠氮化物。待被缀合的肽可包含炔 烃，其用作互补点击试剂。或者，所述肽可包含叠氮化物并且所述寡 核苷酸可包含炔烃。应当理解，可使用其它缀合方法来实现核酸至肽 的缀合。例如，该第一步骤还可使用磺基琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚 胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)将胱氨酸(肽中的)偶联于胺官 能化的寡核苷酸来实现。