[发明专利]具有CL2A接头的抗体-SN-38免疫缀合物

权利要求书

1.一种产生具有如下结构的化合物CL2A-SN-38的方法，

所述方法包括进行如所显示的反应方案：

2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括将SN-38与叔-丁基二甲基氯硅烷(TBDMS-Cl)反应以产生10-O-TBDMS-SN-38(中间体4)，其中在二氯甲烷溶剂中进行所述反应。

3.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括将10-O-TBDMS-SN-38(中间体4)与三光气和DMAP反应以产生10-O-TBDMS-SN-38-20-O-氯甲酸酯(反应性中间体5)，其中通过将三光气添加至含有中间体4的二氯甲烷反应混合物中进行所述反应，并且分批添加所述三光气以在大规模生产中减少放热反应并维持高反应收率。

4.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括用庚烷沉淀Lys(MMT)-PABOH(中间体2)。

5.根据权利要求4所述的方法，所述方法还包括测定所述沉淀的中间体2中的残留二乙胺，并且如果检测到二乙胺的存在，通过层析纯化所述沉淀。

6.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括通过铜催化的环化加成反应将叠氮基-PEG-Lys(MMT)-PABO-CO-20-O-SN-38(中间体7)与MCC-炔(中间体8)反应以产生MCC-PEG-Lys(MMT)-PABO-CO-20-O-SN-38(中间体9)，其中进行所述反应14小时以提高产物收率。

7.根据权利要求6所述的方法，其中首先通过硅胶层析纯化中间体9，随后用EDTA提取以除去铜。

8.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括将CL2A-SN38的马来酰亚胺部分与蛋白质或肽反应以产生缀合有SN38的蛋白质或肽。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述马来酰亚胺部分与蛋白质或肽上的还原的巯基反应。

10.根据权利要求8所述的方法，其中所述蛋白质或肽为抗体或抗原结合抗体片段并且所述缀合有SN-38的抗体或抗体片段为免疫缀合物。

11.根据权利要求10所述的方法，所述方法还包括通过正切流动过滤(TFF)纯化所述免疫缀合物。

12.根据权利要求10所述的方法，其中使用25至30个透析过滤体积的缓冲液，利用50,000道尔顿分子量截断值的膜进行所述TFF。

13.根据权利要求12所述的方法，所述方法还包括在pH为6.0至7.0的Good氏生物缓冲液中配制所述免疫缀合物以及冷冻干燥所述免疫缀合物以进行贮存。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述Good氏生物缓冲液选自由以下组成的组：2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸(HEPES)和1,4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)，pH在6-7的范围内，优选pH在6.5至7的范围内，并且缓冲液浓度为10-100mM，优选25mM。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述缓冲液为25mMMES缓冲液，pH6.5。

16.根据权利要求10所述的方法，其中所述抗体为双特异性抗体或单克隆抗体。

17.根据权利要求10所述的方法，其中所述抗体片段选自由以下组成的组：F(ab′)₂、F(ab)₂、Fab′、Fab、Fv、scFv、单结构域抗体和IgG4抗体的半分子。

18.根据权利要求10所述的方法，其中将所述抗体或抗体片段附接于1至12个拷贝的CL2A-SN38。

19.根据权利要求10所述的方法，其中将所述抗体或抗体片段附接于6个拷贝的CL2A-SN38。

20.根据权利要求10所述的方法，其中将所述抗体或抗体片段附接于1至5个拷贝的CL2A-SN38。

21.根据权利要求10所述的方法，其中所述抗体为抗-癌抗体、抗-感染性疾病抗体或抗-自身免疫性疾病抗体。