[发明专利]用于治疗肌肉萎缩的外显子跳跃组合物

说明书

本发明描述了能够结合在人类抗肌萎缩蛋白基因中的选定的靶标位点以诱发外显子53跳跃的反义分子。

相关申请

本专利申请要求2013年3月14日提交的美国临时专利申请61/782,706号的权益。上文提到的临时专利申请的全部内容通过引用结合到本文中来。

发明领域

本发明涉及适合促进在人类抗肌萎缩蛋白基因中的外显子跳跃的新反义化合物和组合物。还提供了使用适用于本发明方法的新反义组合物诱发外显子跳跃的方法。

发明背景

反义技术正使用各种化学发展以实现各种不同的水平的基因表达(转录、剪接、稳定、翻译)。大量研究集中在使用反义化合物来矫正或补偿在广泛的适应症中的异常或疾病相关的基因。反义分子能够特异性地抑制基因表达，并且因为此，考虑寡核苷酸作为基因表达的调整剂的许多研究工作集中在抑制靶向基因的表达或顺式作用元件的功能。反义寡核苷酸通常指向RNA，即有义链(例如，mRNA)或在一些病毒RNA靶标的情况下负链。为了实现特异性基因下调的期望效果，寡核苷酸通常促进靶向mRNA的衰变、阻断mRNA的翻译或阻断顺式作用RNA元件的功能，由此有效地防止靶标蛋白质的从头合成或病毒RNA的复制。

然而，在旨在上调天然蛋白质的产生或补偿诱发翻译的过早终止的突变如无义或移码突变的情况下，这样的技术是不可用的。在这些情况下，缺陷型基因转录体将不会经历靶向降解或空间抑制，因此反义寡核苷酸化学将不会促进靶标mRNA衰变或阻断翻译。

在多种遗传性疾病中，突变对于基因的最后表达的影响可经由在剪接过程期间靶向外显子跳跃的过程调整。该剪接过程通过复杂的多组分机制引导，所述机制使在前-mRNA中的邻近外显子-内含子接点紧靠着并执行在内含子的末端的磷酸二酯键的裂解，其随后在将一起剪接的外显子之间再形成。该复杂且高度精确的过程由在前-mRNA中的序列基元介导，这些序列基元为相对较短的半保守RNA链段，随后在剪接反应中包括的各种核剪接因子与其结合。通过改变剪接机制读取或识别在前-mRNA加工中包括的基元的方式，可以产生区别性剪接的mRNA分子。现在已经认识到大多数人类基因供选地在正常基因表达期间剪接，不过尚未鉴定出所包括的机理。Bennett等(美国专利6,210,892号)描述使用不诱发靶标RNA的RNAse H-介导的裂解的反义寡核苷酸类似物反义调整野生型细胞mRNA加工。该发现能够用于产生缺乏特异性外显子的供选剪接的mRNA(例如，如(sazani, kole等，2007)描述，从而产生缺乏编码跨膜域的外显子的可溶性TNF超家族受体。

在正常功能蛋白由于其中的突变而过早地终止的情况下，已经显示经由反义技术修复一些功能蛋白产生的方法可以经由在剪接过程期间的干预进行，并且如果与引起疾病的突变相关的外显子可从一些基因上特异性地缺失，则有时可生成缩短的蛋白质产物，其具有与天然蛋白质类似的生物性质或者具有足以缓解由与该外显子相关的突变引起的疾病的生物活性(参见，例如Sierakowska, Sambade等，1996；Wilton, Lloyd等，1999；vanDeutekom, Bremmer-Bout等，2001；Lu, Mann等，2003；Aartsma-Rus, Janson等，2004)。Kole等(美国专利号5,627,274、5,916,808、5,976,879和5,665,593)公开了使用不促进靶向的前-mRNA的衰变的修饰的反义寡核苷酸类似物抗击异常剪接的方法。Bennett等(美国专利号6,210,892)描述还使用不诱发靶标RNA的RNAse H-介导的裂解的反义寡核苷酸类似物反义调整野生型细胞mRNA加工。

靶向外显子跳跃的方法可能特定地可用于长基因中，在这些长基因中，存在许多外显子和内含子，其中在外显子的遗传成分中存在冗余或其中蛋白质能够在没有一种或多种特定外显子的情况下起作用。重新定向基因加工来治疗与由在各种基因中的突变引起的截断相关的遗传性疾病的努力已经集中在使用如下反义寡核苷酸：(1) 与在剪接过程中包括的元件完全或部分地重叠；或(2) 在充分靠近该元件的位置处结合前-mRNA以破坏将通常介导在该元件处发生的特定剪接反应的剪接因子的结合和功能。