[发明专利]使用HLA标志物测定母体血液中的胎儿DNA的分数的方法

说明书

1997年在母体血液中发现无细胞胎儿DNA已经开启了非侵袭性产前诊断和筛选的新领域。循环胎儿DNA的用途包括Rh组基因分型以及筛选非整倍性和单基因疾病，综述于Jiang,P.,等人(2012)FetalQuant:deducingfractionalfetalDNAconcentrationfrommassivelyparallelsequencingofDNAinmaternalplasma,Bioinformatics28:2883。此类诊断应用需要母体循环中存在的总DNA内的胎儿DNA的分数(也被称为“胎儿分数”)的知识。对于一些应用，这将是仅仅质量控制问题。例如，由CLIA实验室提供的一些目前的商业非侵袭性产前诊断(NIPD)测试表明，如果母体血浆中的DNA的<4%是胎儿的，则测试结果将是无法得出结论的，所以不运行测试。对于其他应用，诸如非整倍性和隐性等位基因的拷贝数的检测，胎儿分数的精确测定是必需的。

目前定量母体血浆中的胎儿DNA的方法涉及检测Y染色体基因座(例如，SRY或DYS14，美国专利号6,258,540)；检测胎儿表观遗传标志物(例如，基因乳腺丝抑蛋白、RASSF1A和SERPINB2的甲基化模式，综述于Hahn,S.,等人,(2011)Cell-freenucleicacidsaspotentialmarkersforpreeclampsia,Placenta,32:s17)；或希望发现可以区分母本DNA与胎儿DNA的有信息的单核苷酸多态性(SNP)，而靶向大量的染色体基因座(美国申请系列号12/644,388)。基于Y-染色体的方法的明显缺点是其不适用于女性胎儿。由于缺乏可重复性，表观遗传方法是不佳的。使用多个SNP的方法(例如，Jiang，等人，同上)在整个基因组寻找有信息的SNP中需要复杂数学分析。测定胎儿分数的更可预测且精确的方式是期望的。

发明概述

本发明是测定样品中胎儿核酸的分数的方法，其包括：定量检测所述样品中的至少一种非母本HLA等位基因；定量检测所述样品中在相同基因座的至少一种母本HLA等位基因；使用上述检测的量，测定所述样品中胎儿核酸的分数。在一些实施方案中，所述测定步骤包括计算步骤中测定的所述非母本HLA等位基因的量与所有HLA等位基因的量的总和的比率的2倍。在一些实施方案中，所述至少一种非母本和母本HLA等位基因选自HLA-A、HLA-B、HLA-C、DRB1、DRB3、DRB4、DRB5、DQA1、DQB1、DPA1和DPB1等位基因、或HLA-A，外显子2和3；HLA-B，外显子2和3；HLA-C，外显子2和3；DQA1，外显子2；DQB1，外显子2和3；DPA1，外显子2；DPB1，外显子2；DRB1，外显子2；DRB3，外显子2；DRB4，外显子2；和DRB5，外显子2或来自所述HLA基因的内含子序列或来自所述基因的外显子和内含子序列的组合。在一些实施方案中，所述HLA等位基因通过包括以下的方法定量检测：测序，具体而言克隆测序和任选包括克隆扩增的步骤。在一些实施方案中，所述克隆扩增步骤用正向引物和反向引物进行，各引物包含衔接序列和HLA-杂交序列。在一些实施方案中，所述方法包括在测序之前的目标富集步骤，例如，通过至少一轮基因组DNA扩增或通过目标捕获。在一些实施方案中，所述HLA等位基因通过包括以下的方法定量检测：用正向引物和反向引物扩增，以获得HLA扩增子；进行克隆测序以测定HLA扩增子的序列；鉴定在相同基因座的至少一种母本HLA等位基因和至少一种非母本HLA等位基因；比较母本和非母本HLA序列克隆的数目，从而测定所述样品中胎儿核酸的分数。在一些实施方案中，所述鉴定步骤包括以下计算步骤：将在所述HLA基因座的序列与HLA序列数据库进行比较；将所述序列分选至对应于已知HLA等位基因的多个箱(bins)；将一个或两个多数序列鉴定为母本等位基因；将一个或两个最代表的少数序列鉴定为非母本等位基因。在一些实施方案中，所述比较步骤包括计算所述鉴定步骤中鉴定的在相同基因座的所述非母本HLA等位基因与HLA等位基因的总数的比率的两倍。在一些实施方案中，测定HLA扩增子的序列包括边合成边测序(sequencingbysynthesis)。在一些实施方案中，在两个、三个或更多个基因座(例如，DPB1、DQB1和DRB1)检测在相同基因座的所述非母本HLA等位基因和所述母本HLA等位基因。在一些实施方案中，在相同反应体积中通过多重PCR同时扩增在两个、三个或更多个基因座的所述非母本和母本HLA等位基因。在一些实施方案中，所述HLA等位基因通过包括数字PCR的方法定量检测。在一些实施方案中，所述HLA等位基因通过包括以下的方法定量检测：将所述样品分成多个反应体积，各自包含零至近似五个拷贝的目标HLA等位基因；测定各反应体积中目标HLA等位基因的存在；将含有所述非母本HLA等位基因的反应体积的数目与含有在相同基因座的母本HLA等位基因的反应体积的数目进行比较，从而测定所述样品中胎儿核酸的分数。在本实施方案的变型中，所述测定包括通过数字PCR扩增。在一些实施方案中，所述方法进一步包括独立获得在至少一个HLA基因座的父母一方或双方的基因型信息。