[发明专利]细菌人工染色体

说明书

发明领域

本发明涉及适于操作、维持并增殖RNA病毒基因组的感染性cDNA的质粒载体系统，以及所述载体系统的应用。

背景技术

先前，已将数种黄病毒和其它RNA病毒的拷贝DNA(cDNA)克隆进入不同低拷贝细菌载体，以克服其固有的毒性(归因于病毒序列的大尺寸和隐蔽表达)(Bredenbeek等.(2003)J.Gen.Virol.84，1261-1268；Durbin，等.(2006)HumVaccin.2，255-260；Fan和Bird(2008)J.Virol.Methods.149，309-315；Li等.(2011)PLoSOne6，e18197；Pu等.(2011)J.Virol.85，2927-2941；Rice等.(1989)NewBiol.1,285-296)Almazán等.(2008)MethodsMolBiol.454，275-91)。已将克隆的cDNA作为模板使用，以产生感染性重组病毒，通过体外合成或RNA基因组的转染(Bredenbeek等，2003，如上所引)，或通过将该病毒cDNA纳入表达盒，该表达盒包含启动子，例如允许从转染的质粒DNA转录病毒RNA的CMV-IE(巨细胞病毒即刻早期(immediateearly))启动子(Enjuanes等.(2001)J.Biotechnol.88，183-204；Hall等.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.100，10460-10464)。引导减毒的手足口病(Ward等.(1997)J.Virol.71，7442-7447)和库宁病毒(Hall等.(2003)ProcNatlAcadSciUSA.100，10460-10464)的表达的所述病毒表达盒已被用作实验DNA疫苗。尽管包含病毒表达盒的低拷贝数载体系统能以稳定的方式保持在细菌宿主细胞中，它们存在重要缺陷：其仅允许以仅仅足够于小规模实验应用的量纯化感染性病毒cDNA。因此，其作为感染性病毒cDNA的常规来源的应用(例如在活cDNA疫苗生产中的应用)是不可能的。

病毒DNA疫苗的生产需要大量扩增克隆载体，以获得足够的DNA，但这些扩增方法受到严重的约束。为了避免突变，包含病毒DNA的载体在防止诱变事件(重组、突变、增加错配修复等)的条件下增殖。细菌人工染色体(BAC)的稳定性是已知的，并且其可包含多达500kb或更多的插入。

然而，带有外源DNA的这种载体的大小对于细菌而言是个沉重负担，并且其复制需要大量代谢努力。此外，核苷酸的耗尽可导致突变增加。最终，会出现外源DNA的不希望的表达(所谓隐蔽表达)，这可造成毒性重组蛋白质。隐蔽转录本的毒性蛋白质的产生是黄病毒DNA所固有的，并且仅能通过降低质粒的拷贝数来解决。事实上，载体的拷贝数越高，毒性蛋白质的浓度越高。结果是，细菌宿主可能会相反选择(counterselect)突变，其中这些蛋白质不表达。

Pu等.(2011)J.Virol.85，2927–2941，详细描述了解决细菌中的黄病毒cDNA的固有毒性的各种尝试。这些包括包含病毒基因组的部分的质粒的体内连接、特定宿主、避免隐蔽表达的突变体，以及低拷贝数质粒。

因此，在细菌中以单一拷贝出现的BAC的应用为这些问题提供了解决方案。

低拷贝数不是这些应用的缺点，其中BACDNA随后被亚克隆或扩增以提高浓度，并且其中通过这些技术引入的一些突变对于设想的实验并不是至关重要的。然而，所述扩增方法无法应用于DNA疫苗的制造中，这使得BAC在DNA疫苗的大规模质粒制备中并不是优选的载体。需要超大规模培养来获得大量的BAC。

从Wild等.(2002)基因组Res.12，1434-1444已知诱导型BAC载体的应用，由此，BAC的拷贝数从每细胞1个拷贝增加至多达每细胞100个拷贝或甚至更多。尽管该系统提供了增加BACDNA产量的方法，还是存在合理的担心，即，诱导后复制系统的活性的强力增加会增加突变频率。因此，DNA疫苗的制造需要这样一种系统，其中所述系统能够获得载体的高拷贝数，但其中所述载体发生复制却不引入无法耐受的突变。

发明内容