[发明专利]包含RAMP功能的通用蛋白质过表达标记及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及在细胞中能够改善重组蛋白质的难表达/不表达问题的合成标记。更具体地说，通过使标记(tag)在转录或翻译阶段中、在目标基因的内/外部一起行动(通过tRNA的选择诱导和再使用提供而调节翻译速度)，从而改善杂合基因中存在宿主的稀有密码子(rare codon)时成为问题的翻译速度阻碍以及非均匀的蛋白质表达问题，稳定地诱导蛋白质的功能性过表达。

背景技术

有用蛋白质通常可以大致分为诸如免疫调节剂、酶抑制剂和激素之类的医药及诸如研究用蛋白质和诊断用蛋白质或反应添加酶之类的工业用蛋白质。在大量生产这样的蛋白质的过程中，务必需要基因表达、培养、纯化技术。特别是表达技术在生产工艺技术过程中占据最重要的部分，是判断经济性的核心指标，因此其是提高附加价值和效用性的主要工艺。以往为了获得特定蛋白质，使用了如下方法：筛选出生产性高的细菌或动物细胞株，由此生产所需的蛋白质，并进行分离纯化。但是，就这样的方法而言，收率有限，且在应用于其它蛋白质的情况下，不仅无法确保相等的生产性，而且在获得优质(形态/结构/功能上相同的蛋白质)的产品方面上存在很多问题。目前，随着基因重组(遗传工程学)技术的发达，普遍使用如下方法：将有用基因转化到大肠菌或动植物细胞株等中，容易获得大量的所需蛋白质。特别是生产性与费用有关，因此利用具有能够在价格比较低的培养基中快速且以高浓度培养的优点的微生物(大肠菌、酵母或放线菌等单细胞)的重组蛋白质的大量生产在商业方面具有很大的优点是已为人所知的。此外，就这些宿主而言，已经查明了生理/遗传学特性，且用于操作重组基因的有效方法和技术的发展良好。因此，由于具有能够高效获得目标杂合有用蛋白质的优点，成功地生产了胰岛素等医/药用蛋白质和工业用酶等。已知，在具有相对复杂的生理/遗传现象和调节机制的动植物宿主的情况下，需要很难的基因操作/调节过程，因此实际情况是，对于适用于生物体的医药用蛋白质以外的外源基因表达，利用频率相对低。但是在利用通用的表达调节机制的情况下，能够克服这样的缺点，因此对于能够同样应用于包括原核细胞株的所有真核细胞株的表达调节法的开发或改良，正在进行大量研究。

用于生产重组蛋白质的表达系统在载体、宿主、ORF(开放读码框(open reading frame))水平上试图接近工程方法，与此关联开发的技术的原型(prototype)较为人所熟知的(Marino，M.H.，Biopharm.2(1989)18-33；Goeddel，D.V.et al.，Methods Enzymol.185(1990)3-7；Wurm，F.and Bernard，A.，Curr.Opin.Biotechnol.10(1999)156-159)。通过以这种原型技术为基础的各种策略和技术变形，报道了很多外源基因的成功表达，但实际情况是，由于泛化逻辑的缺乏，通常要求根据特定基因重优化表达系统构成要素的一部分或者全部的过程。在这样的过程中，利用通过强启动子和调节因子的组合而诱导转录物量增加的策略和以转录物的二级结构、热力学稳定性增加为主的表达策略。但是已知，这样的策略缺乏可应用于所有蛋白质的泛化逻辑，更重要的是，仍存在与转录物和翻译的蛋白质量没有明显的相关关系的情况频繁发生的问题。最近，作为解决这样的问题的对策，与蛋白质翻译效率增加或者速度调节有关的新的表达策略被已知为可泛化的潜在逻辑。