[发明专利](‑)γ‑内酰胺的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种γ-内酰胺酶的固定化制备及其拆分方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

(1R,4S)-2-氮杂双环-[2.2.1]-庚烷-5-烯-3-酮((-)γ-内酰胺)是用于制备碳环核苷类抗病毒药物的重要手性中间体。例如用于抗艾滋病的重要药物阿巴卡韦、卡巴韦和用于抗流感病毒的帕拉米韦都能以(-)γ-内酰胺为原料制备。

目前制备(-)γ-内酰胺的方法主要有不对称合成法和外消旋体拆分法，外消旋拆分法中的生物酶拆分法由于其独特的优点，受到科研及生产人员的倍加重视和开发。生物酶法拆分主要利用具有高度立体选择性酶对外消旋γ-内酰胺进行拆分，去除(+)γ-内酰胺，获得(-)γ-内酰胺，其反应条件温和、环境污染小、产品的光学纯度高。

第一次报道使用生物酶法对外消旋γ-内酰胺进行拆分的是Nakano hiroto等，使用的是脂肪酶。Talor等使用全细胞的转化实验，利用酰胺酶拆分外消旋γ-内酰胺，并取得了较好的拆分效果。之后，Taylor等对食酸丛毛单胞菌(Comomonasacidovorans)中的内酰胺酶进行鉴定、分离和克隆，并将(+)γ-内酰胺酶的基因在大肠杆菌中克隆表达，使得重组后的大肠杆菌能够耐受500g/L的底物，具有较高的工业化潜力。

硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)中的(+)γ-内酰胺酶具有较强的温度稳定性、易于纯化，并且具有绝对的立体选择性。国内的相关研究相对较少，李海泉等从土壤中筛选得到一株具有高活力的(+)γ-内酰胺酶的微杆菌，经过鉴定为氧化烃微杆菌(Microbacteriumhydrcarbonixydans)，北京化工大学的郑国钧等对来源于的(+)γ-内酰胺酶进行了相关研究，并将其基因成功克隆至大肠杆菌中，构建了(+)γ-内酰胺酶的重组菌株。江南大学的倪晔等将PseudonmascepaciaDSM9959整体细胞进行固定化，并应用于拆分γ-内酰胺。

本发明使用的酶液来源于带有硫磺硫化叶菌(+)γ-内酰胺酶基因的大肠杆菌工程菌发酵并处理获得。具有较好的拆分效果，由于游离酶在各种理化因素(如温度、压力、有机溶剂、离子强度)下比较容易变性失活，甚至在最适条件下也会部分失活，使得反应时间延长。同时，游离酶在拆分反应后无法回收重复利用，从而增加了生产成本和加大了产物提取的难度。因此游离酶的工业化效果并不理想。

发明内容

本发明的目的在于解决上述的技术问题，提供一种(-)γ-内酰胺的制备方法。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

(-)γ-内酰胺的制备方法，包括如下步骤：

S1、共价结合法固定化γ-内酰胺酶；

S2、拆分γ-内酰胺酶制得(-)γ-内酰胺；

其中，所述S1包括，

S11、预处理步骤：

a、洗涤，用2-5倍质量体积比的0.2mol/L、pH＝7.0-9.0的磷酸缓冲液对伯氨基树脂用磷酸盐缓冲液洗涤2-3次，过滤得到洗涤平衡的伯氨基树脂，所述最终树脂的平衡pH值为6.5-8.5；

b、预活化，在洗涤后的伯氨基树脂中加入戊二醛溶液进行树脂的预活化，使混合物的终浓度为1％-6％，在室温下连续搅拌4-8h，过滤得到固定前树脂；所述反应式如下：

S12、制备酶液：

c、菌体制备，将含有硫磺矿硫化叶菌(+)γ-内酰胺酶基因的大肠杆菌工程菌进行发酵，罐上发酵条件为：温度37℃，通气量1vvm，转速偶联溶氧，使溶氧范围为20-50％之间，诱导剂为乳糖，发酵时间16h。离心获得湿菌体；

d、将获得的湿菌体按照200g/L置于0.1mol/L、pH＝7.0的磷酸盐缓冲液中进行重悬，菌悬液使用高压匀质机匀质2-5次，压力不低于800bar；

e、匀质后的破碎液于80℃处理10-15min，以9000rpm离心5min，去除沉淀杂质，获得上清酶液；

S13、共价结合固定化酶：

f、混合，将经预处理后的树脂与获得的酶液按1:5-10的比例混合，在室温下搅拌固定12-24h；

g、过滤，过滤去除混合后的残留酶液，得到γ-内酰胺酶；

所述S2包括，

S21，在g得到的γ-内酰胺酶中加入γ-内酰胺和去离子水，在40℃进行搅拌反应，进行拆分转化得到(-)γ-内酰胺，所述γ-内酰胺酶与γ-内酰胺的质量比为1:1。

优选地，所述γ-内酰胺酶的蛋白浓度＞0.5g/L。