[发明专利]Notch配体Delta-like1融合蛋白的纯化与复性的方法

说明书

发明领域

本发明属于生物技术中变性蛋白复性技术领域，特别涉及一种Notch配体Delta-like1融合蛋白的纯化与复性的方法，利用离子交换色谱及排阻色谱纯化与复性Notch配体Delta-like1融合蛋白。

技术背景

Notch因1916年Morgan在果蝇中发现部分突变可在果蝇翅膀的边缘造成缺口(Notch)而得名。Notch信号是通过局部细胞间的相互作用以控制细胞命运的一种途径，在进化中高度保守，广泛表达于胚胎和成年个体组织。该信号途径包括配体DSL(Delta/Serrate/Lag-2，DSL)、受体以及下游分子和调节分子组成。目前哺乳动物中已发现4种Notch受体蛋白，分别为Notch1-4；这些受体分子有5种配体，分别为Delta-like1、3、4和Jagged 1、2。这些受体/配体在结构上具有高度同源性，转录因子RBP-J(recombination binding protein-J，RBP-J)是哺乳动物Notch信号途径的主要核内效应物。当Notch的配体与受体结合后，触发三次酶切反应后释放NICD进入细胞核。进入细胞核的NICD通过RAM结构域与转录因子CSL(CBF1/Suppressor of Hairless/Lag-1，CSL)相互作用，使与CSL相结合的由SMR、SHARP、CIR和HDAC等分子所组成的转录共抑制复合物解离，并为之募集由GCN5、P300、SKIP和MAML1等分子组成的转录共激活复合物，使CSL由转录抑制转切换为转录激活，从而调节下游基因的表达。其中人Delta-like 1(Dll1)由723个氨基酸组成，为一次跨膜蛋白，其胞外段中有8个EGF样结构域和1个DSL基序。它可以和相同或不同的Notch受体结合，激活Notch信号通路，参与调控多种组织的生长发育，在造血细胞、胸腺细胞、骨髓间质细胞等表面均有表达，对诱导它们的分化中起重要作用。

大肠杆菌(E.coli)作为基因工程蛋白生产最常用的表达体系，具有在快速表达的同时即可获得高密度重组蛋白的特点一直非常受人钦睐。但是，高效表达的目标蛋白质因缺乏翻译后的加工与修饰，常会以无活性、不溶性包涵体形式存在而限制了重组蛋白的应用。继稀释法、透析法、人工分子伴侣等体外辅助蛋白复性方法的出现，蛋白折叠液相色谱法(PFLC)法已经成为了一种更有效的蛋白复性与同时纯化方法。其中高效离子交换色谱法(HPIEC)利用不同蛋白质的带电部分与表面带有相反电荷固定相间吸附强弱不同，通过改变不同洗脱强度的流动相，进行吸附-解吸附-再吸附的复性，并同时被纯化，这种方法在大规模提纯蛋白上存在着潜在的优势[Wang CZ，et al，Appl Biochem Biotechnol2008；144：181-189]，利用弱阴离子交换柱DEAE-FF在3h内对重组人甲胎蛋白(rhAFP)复性与纯化，折叠产率比稀释法高9倍，纯度达95％[Chen Y，et al，J Chromatogr A.2009；1216：4877-4886]。通过对流动相中脲浓度、GSH/GSSG浓度比及pH等优化，用强阴离子交换实现了高纯度和质量回收率的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)[Bai Q，et al，Biotechnol Prog，2007；23：1138-1142]。虽然，相比于离子交换色谱法，高专一性的亲和色谱对重组蛋白的纯化与复性能带来更高的纯度倍数，但是，除了固定相成本高这一缺点外，在对重组蛋白载体的构建时需要加入GST、His等纯化标签，复性完成后还要通过RPLC等方法将蛋白与纯化标签分离[Wilkinson RJ，et al，Protein Expres Purifi.2004；35：334-343]，过程繁琐，并不适用于大量生产。因此，在对重组蛋白的复性及纯化过程中，尤其是需要大规模生产时，如何在短周期、低成本的条件下获得大量高纯度的重组蛋白具有重要意义。

发明内容

为克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种Notch配体Delta-like1融合蛋白的纯化与复性的方法，它是可溶性人Notch受体的配体蛋白Dll1与RGD融合表达的产物，本发明用PFLC法，具体为阴离子交换色谱法及排阻色谱法对获得的包涵体进行了复性并同时纯化；该方法工艺简单，可实现规模化生产，得到的高产量和高纯度的馏分可为Notch信号途径的深入研究提供有效的实验工具。

为实现上述目的，本发明中采用的技术方案是：一种Notch配体Delta-like1融合蛋白的纯化与复性的方法，包括以下步骤：