[发明专利]一种副溶血性弧菌的恒温扩增检测试剂盒及检测方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种针对副溶血性弧菌核酸的恒温扩增快速检测技术，适合对副溶血性弧菌的定性检测。

(二)背景技术

副溶血性弧菌是广泛分布于沿海地区的海洋性细菌，近年来根据国家食源性疾病监测网报告，副溶血性弧菌是引起食源性疾病的主要病原。自1998年后由副溶血性弧菌引起的中毒起数呈显著上升趋势，已居各种微生物食源性疾病之首，严重影响我国人民的食品安全与旅游业发展。如何预防与快速处置由副溶血性弧菌引起的食物中毒，快速检测技术的开发倍受各级政府和卫生部门的关注。传统的细菌培养法主要靠形态学判别、生化反应和血清学凝集等实验方法，存在着受培养条件、试剂等因素影响大、阳性率低、检测时间长等缺点。近年来荧光定量PCR技术的使用，使副溶血性弧菌的检测时间可缩短至2小时左右，但由于需要昂贵的荧光定量PCR仪，使得难以在基层广泛使用。恒温扩增技术是继PCR技术后近年发展起来的一种新的体外核酸扩增技术，本发明技术研制了恒温扩增副溶血弧菌核酸，并结合核酸试纸条显色来判定检测结果，且整个反应过程不打开反应管盖子，试纸条流动检测过程密闭，杜绝了核酸扩增产物污染外界的可能性。研究表明该副溶血性弧菌恒温扩增-核酸试纸条检测方法具有特异性强、敏感度高、对仪器要求简单、检测时间短等优点，所以非常适用在基层检验机构使用，同时在突发公共卫生事件的现场检测与临床上的床边诊断上也具有很好的应用前景。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种准确、灵敏、快速地检测副溶血性弧菌核酸的恒温扩增检测试剂盒及其检测方法。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种副溶血性弧菌恒温扩增检测试剂盒，所述试剂盒包括如下组成：

(1)DNA提取试剂(优选Takara公司的Bacterial Genomic DNA Extraction Kit(货号DV810A)；

(2)恒温PCR扩增反应液，包括：正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条交叉扩增引物、1×Thermol buffer、MgSO₄、dNTPs溶液、Bst DNA聚合酶和无菌双蒸水；其中：

所述的外围引物分别为：

所述正向外围引物为：5′-TCATCTAAACAATGTTATAGCCA-3′；

反向外围引物为：5′-GGTTTGGTTTTCTTGCGT-3′；

所述两条探针的序列分别为：

正向5’端Biotin标记探针5′-Biotin-CTCTTCTTGTAATGGTTATTG-3′；

反向3’端FitC标记探针5′-Fitc-CCAACCTTATCACCAGAAATGG-3′；

所述两条扩增交叉引物分别为：

扩增正向引物：

5′-CGGGAGTAATGCAGTTAATAGTGTGTTTTTCAATGTGCTTGGGT-3′；

扩增反向引物：

5′-CTTCTGCAGTTGCCGAAGAGCTGATCACTTCAGACGCT-3′；

(3)阳性对照：含有副溶血性弧菌TLH基因片段的DNA质粒；

(4)阴性对照：无菌双蒸水。

进一步，本发明所述的1×Thermol buffer组成为：20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH₄)₂SO₄、2mM的MgSO₄以及质量浓度为0.1％的Triton X-100，pH 8.8。

进一步，本发明所述阳性对照为含有长200bp的副溶血性弧菌不耐热溶血素基因序列的片段，所述片段的核苷酸序列如下(SEQ ID NO.1)：

TCATCTAAACAATGTTATAGCCAAGTATTTTTTCAATGTGCTTGGGTCAATAACCATTACAAGAAGAGTGAATGATGAAAAAAACAATCACACTATTAACTGCATTACTCCCGCTTGCTTCTGCAGTTGCCGAAGAGCCAACCTTATCACCAGAAATGGTTTCAGCGTCTGAAGTGATCAGCACGCAAGAAAACCAAACC。

进一步，本发明所述阳性对照按如下步骤制备：