[发明专利]一种复合菌剂及其制产纤维素酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种复合菌剂及其制产纤维素酶的方法，属于农业发酵技术领域。

背景技术

随着畜牧业的迅猛发展，如何提高粗饲料的营养价值并增加其瘤胃消化率已成为全球研究的热点。近年来，青贮或日粮中添加纤维素酶制剂引起了人们的广泛关注，然而受各种因素的影响，如酶的生产成本、种类和添加量、酶的反应条件等，其推广使用尚存在一些限制。

对于纤维素酶的生产菌株，以往的研究多集中在纯化菌，但在以秸秆等天然木质纤维素材料为底物时，纯化菌株定植缓慢，产酶效率低。近年来研究发现在发酵过程中将微生物共培养能够增加纤维素酶的量，筛选构建复合系对木质纤维素进行降解和生产纤维素酶成为研究热点。

另外，现有的酶制剂生产工艺包括液态发酵(Submerged Fermentation，SmF)和固态发酵(Solid-state Fermentation，SSF)。但液态发酵存在木质纤维素材料的降解难度大，转化成本高的缺陷，因此固态发酵产酶成为具有应用前景的技术手段。

然而现有生产纤维素酶的方法存在效率低、成本高的缺陷，远没有满足实际生产需求，因此需要寻找一种高效的产酶菌、产酶工艺和廉价的发酵底物。

发明内容

本发明第一目的是提供一种复合菌剂，以秸秆为底物，对其进行固态发酵生产木质纤维素酶，所得纤维素酶的活力高，提高了产酶效率，降低了酶的生产成本，同时也增加了秸秆的利用率，为秸秆等农业废弃物的利用及非常规饲料的开发和应用提供了新途径。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种复合菌剂，是由缓纤维梭菌、解木聚糖拟杆菌、噬纤维菌、灰盖鬼伞菌分别接种于培养基，发酵培养后将发酵液混合得到的发酵混合液；其中所述发酵混合液中缓纤维梭菌、解木聚糖拟杆菌、噬纤维菌、灰盖鬼伞菌的菌落形成单位数目比为20-25：15-20：15-20：40-50，菌落形成单位数目为0.8×10⁶-1.2×10⁶CFU。

其中，所述缓纤维梭菌(Clostridium lentocellum)，其保藏编号为ATCC 49066。

所述解木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanisolvens)，其保藏编号为DSM 18836。

所述噬细胞菌(Cytophaga sp.)，其保藏编号为ATCC13125。

所述灰盖鬼伞菌(Coprinus cinereus)，其保藏编号为CGMCC NO.4051。

所述培养基为Mandels培养基，其配方如下：

同时在培养基中添加小麦秸秆作为唯一的碳源，长度为2-3cm，添加量为前述培养基总质量的1％。

所述发酵培养条件为：33-37℃静止培养7d。

上述复合菌剂还可制成本领域常用固体剂型，所述固体复合菌剂是由上述发酵混合液与载体按0.8×10⁶-1.2×10⁶CFU：(1－10)g比例配制而得；优选地，所得发酵混合液与载体按1×10⁶CFU：5g比例配制。

所述载体为麦饭石和/或秸秆粉。

本发明的另一个目的是提供一种高效低廉制产纤维素酶的方法，是以秸秆为底物，将复合菌剂接种到培养基中进行固态发酵培养，得到纤维素复合酶。所述纤维素复合酶包括纤维素酶、半纤维素酶和β-葡萄糖苷酶。

所述方法具体步骤如下：

1)将秸秆粉碎与培养基混合，115-120℃灭菌15-30min，冷却；

2)将上述复合菌剂接种到步骤1)所得体系中，每天搅拌一次，30-35℃培养7-10天，将发酵产物真空干燥，得到固态纤维素复合酶。

其中，所述秸秆为水稻、小麦、玉米或其它木质纤维素材料，长度＜1mm。

所述培养基配方为(g/l)：

所述秸秆与培养基混合比例为5-10:15-20(g/ml)，优选10：15(g/ml)。

所述复合菌剂添加量为每千克培养基中菌落形成单位数目为0.16×10⁶-0.24×10⁶CFU。