[发明专利]一种提高宇佐美曲霉甘露聚糖酶(AuMan5A)催化活性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及宇佐美曲霉甘露聚糖酶(AuMan5A)的酶活性定向改造，甘露聚糖酶突变酶基因的构建和表达，以及该酶的性质研究，属于生物工程技术领域。

背景技术

β-1,4-D-甘露聚糖酶(β-1,4-D-mannan mannohydrolase；EC 3.2.1.78)，简称β-甘露聚糖酶(β-mannanase)，是指一类能够水解含有β-1,4-D-甘露糖苷键的甘露聚糖和异甘露聚糖的内切水解酶，它在动植物和微生物中均广泛存在。由于β-甘露聚糖酶具有降解生物质和生产功能性低聚糖的作用，使得其在食品、饲料、医药、制浆造纸、石油开采等多种行业都具有广泛的应用前景，受到很多研究者的青睐。

目前研究报道的β-甘露聚糖酶多数来源于细菌真菌等微生物，根据序列同源性和空间结构分析，β-甘露聚糖酶都属于糖苷水解酶第5、26和113家族。目前，关于第5家族β-甘露聚糖酶的报道较多，它们的最适pH值为3.0～7.5，最适温度在45～92℃。根据三维结构，所有的β-甘露聚糖酶都属于糖苷水解酶超家族A(clan A)，它们的催化域采用相同的折叠方式，是由八个β折叠和八个α螺旋交替排列组成的(β/α)8-TIM(triosephosphate isomerase)桶状结构。由于β-甘露聚糖酶具有复杂对称的三维结构，使得对其结构与功能的研究一直处于滞后状态。

虽然β-甘露聚糖酶具有广阔的应用前景，但目前已商品化的β-甘露聚糖酶，尤其是国内公司开发出的一些产品，在酶学性质和生产水平等方面尚存在一定的缺陷，例如较低的底物亲和力和比酶活，以及较差的对极端环境的耐受性等，这些都限制了它们在工业生产中广泛和有效的应用。如何筛选和改造出底物亲和力强、比酶活高、极端环境耐受性好的优良酶并有效地应用于工业生产中，已成为现在β-甘露聚糖酶的应用面临的最大挑战。

目前，虽已有一些有关β-甘露聚糖酶基因的克隆和表达的文献和专利报道，但有关β-甘露聚糖酶的分子改造，尤其是基于理性设计的β-甘露聚糖酶的分子改造更是鲜有报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高β-甘露聚糖酶催化活性方法，使得宇佐美曲霉甘露聚糖酶(AuMan5A)的酶活性有了很大的提高，有较大的工业化生产和应用潜力以及经济价值。

本发明的技术方案：将位于宇佐美曲霉甘露聚糖酶(GeneBank accession No.ADZ99027)分子中的反应沟槽内的一段非保守性Loop结构(第316至322位，共7个氨基酸KSPDGGN)替换为与之对应的哈茨木霉甘露聚糖酶(GeneBank accession No.AGH62580)分子中的Loop(第343至350位，共8个氨基酸氨基酸AQSNSDPY)，突变酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，相应的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，并命名为Auman5A^Loop。

携带有宇佐美曲霉β-甘露聚糖酶基因的重组质粒pUCm-T-Auman5A由江南大学构建和保藏(专利申请号：201010550927.4)。

所述的突变酶的活性测定方法：

于两个25mL的具塞试管A和B中，分别加入用pH 3.6、柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液配制的质量浓度为0.5％的角豆胶溶液2.4mL，于50℃恒温水浴中预热10min后，在A管中加入用缓冲液适当稀释的0.1mL酶液，于65℃中准确反应10min；立即在A和B两管中各加入2.4mL 3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂，在B管中再补加0.1mL灭活的酶液，A和B管同时煮沸7min；立即冷却后各加去离子水5mL，摇匀；以B管为空白对照，于540nm处测定A管吸光度值，并从甘露糖标准曲线上查出相应的还原糖(以甘露糖计)含量并折算成酶活性单位。酶活性单位定义：在本测定条件下，以每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量定义为1个β-甘露聚糖酶活性单位(U)。

所述的突变酶基因的设计、克隆及表达：

(1)突变酶基因及其表达质粒的构建：基于上述设计的突变酶对应的基因序列，设计三条引物：

Auman5A-F:5’-GAATTCTCCTTCGCCAGCACCTC-3’，含EcoRⅠ酶切位点，

Auman5A-R:5’-GCGGCCGCTTAGGCACTATCAATAG-3’，含NotⅠ酶切位点，