[发明专利]一种提高宇佐美曲霉甘露聚糖酶(AuMan5A)催化活性的方法

权利要求书

1.一种催化活性提高的宇佐美曲霉甘露聚糖酶突变体AuMan5A^Loop，其核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。

2.甘露聚糖酶酶突变体的构建和表达方法：

(1)突变酶的设计：将位于宇佐美曲霉甘露聚糖酶(GeneBank accession No.ADZ99027)分子中的反应沟槽内的一段非保守性Loop结构(第316至322位，共7个氨基酸KSPDGGN)替换为与之对应的哈茨木霉甘露聚糖酶(GeneBank accession No.AGH62580)分子中的Loop(第343至350位，共8个氨基酸氨基酸AQSNSDPY)；

(2)突变酶基因及其表达质粒的构建：基于上述设计的突变酶对应的基因序列，设计三条引物：

Auman5A-F:5’-GAATTCTCCTTCGCCAGCACCTC-3’，含EcoRⅠ酶切位点，

Auman5A-R:5’-GCGGCCGCTTAGGCACTATCAATAG-3’，含NotⅠ酶切位点，

Thman5A-Loop:5’-TTGAGTACCGGGGCTCAATCCAACTCCGACCCATACACTATCTACTATGG-3’，含突变位点，

采用大引物PCR的方法构建突变酶基因，分别以Thman5A-Loop和Auman5A-R为上下游引物，以pUCm-T-Auman5A为模板进行第一轮PCR；以第一轮PCR产物和Auman5A-F为引物，以pUCm-T-Auman5A为模板进行第二轮PCR，PCR产物采用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-Auman5A^Loop)转化JM109，经菌液PCR鉴定正确后送上海生工测序；测序正确的pUCm-T-Auman5A^Loop与pPIC9Zα质粒均用EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切，回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPICZα-Auman5A^Loop，并对重组表达质粒进行序列测定；

(3)GS115/Auman5A^Loop的构建、表达、产物纯化及酶学性质测定：用SacⅠ对pPICZα-Auman5A^Loop进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/Auman5A^Loop；该基因工程菌用1.0％甲醇诱导表达96h，采用DNS法测得发酵上清液中甘露聚糖酶活性可达350U/mL，是原酶发酵上清液酶活性的7倍；发酵液经离心后的上清液为突变酶的粗酶液，该粗酶液经70％硫酸铵盐析，再经Sephadex G-75凝胶过滤层析和DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析纯化，纯化后经SDS-PAGE检测为单一条带；该突变酶的最适作用温度70℃，最适作用pH 4.0，在最适反应条件下的比酶活高达1870U/mg。