[发明专利]从橡胶树叶片中分离筛选拮抗细菌的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物防治细菌领域，具体来说，涉及一种从橡胶树叶片中分离筛选拮抗细菌的方法。

背景技术

橡胶树炭疽病是橡胶树生产中严重影响胶乳产量和品质的重要病害，病原菌为胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides Penz.)和尖孢炭疽菌(C.acutatum Simmons)，胶孢炭疽菌较尖孢炭疽菌更为常见，尖孢炭疽病为我国橡胶树新发生病害。橡胶树炭疽病为害导致叶片组织坏死或大量脱落，严重时造成大量落叶和嫩梢回枯，树体衰弱，缩短割胶期限，推迟开割时间，使橡胶总产量显著下降。

目前，国内外对橡胶炭疽病开展了一系列研究，主要集中在病害流行及药剂筛选方面。崔昌华等(2006)采用菌落生长速率法在室内进行橡胶树炭疽病菌对三唑酮、丙环唑、百菌清、代森锌、多菌灵5种药剂的敏感性测定。蔡志英等(2008)采用生长速率法室内测定了云南省橡胶炭疽病菌胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌对咪鲜胺、多菌灵、甲基托布津、溴菌腈、百菌清和代森锰锌的敏感性。郑肖兰(2008)采用菌落生长速率法测定了18种橡胶炭疽病菌菌株对保治达等4种常用真菌性药剂的敏感性。王兰英等(2010)研究报道了8种杀菌剂对橡胶炭疽菌孢子萌发的抑制活性。然而，生产上对于橡胶炭疽病的防治仍以化学杀菌剂为主，而化学农药造成的病菌抗药性、毒性和环境污染问题日益突出，已经成为制约农业可持续发展的主要障碍。因此，亟待需要寻找一种具有环境兼容性好、无毒无害的生防微生物，作为化学农药的理想替代品。

发明内容

本发明的目的是提供一种从橡胶树叶片中分离筛选拮抗细菌的方法，包括以下步骤：

(1)采集橡胶感病叶片；

(2)用升汞浸泡叶片，然后用无菌水冲洗；

(3)将叶片放在PDA培养基上，28℃培养48h后将长出的菌体转接至相同的培养基上，28℃培养48h后纯化；同时，将纯化后所得的细菌采用梯度稀释涂布LB平板培养基中，28℃培养48h后挑取单菌落接至相应培养基斜面上；

(4)将单菌落28℃震荡培养约12小时，吸取少量置于LB固体培养基上，涂抹均匀，28℃培养；然后通过无限稀释法处理获得单一菌株；

(5)从菌株中筛选出细菌，转接到LB平板，用涂布平板法得到单菌落；对获得的单菌株与供试菌橡胶树炭疽菌RC178进行对峙培养；

(6)通过观察有无抑菌圈，挑选出现抑菌圈的拮抗细菌。

在一个具体的实施方式中，步骤(1)为：采集不同来源的橡胶感病叶片，清水冲洗；并且剪取大小为5×5mm的小叶片备用。

在一个具体的实施方式中，步骤(2)为：将剪取的小叶片用升汞浸泡30秒，然后用无菌水冲洗3次，晾干。

在一个具体的实施方式中，步骤(3)为：用灭过菌的镊子将剪取的小叶片贴放到PDA固体培养基上，每皿均匀摆放4块，再将培养皿用保鲜膜密封。倒置放入恒温培养箱中，28℃培养。每隔12h进行观察48h后将长出的菌体转接至相同的培养基上，28℃培养48h后进行纯化；同时，将纯化后所得的细菌采用梯度稀释涂布LB平板培养基中，28℃培养48h后挑取单菌落接至相应培养基斜面上。

在一个具体的实施方式中，步骤(4)为：将放置于8～10℃培养箱中的斜面试管取出。在无菌操作台中，将液体LB培养基分装到锥形瓶中，然后用接种针挑去少量的细菌于锥形瓶中，封口。放置于28℃摇床上震荡培养约12小时，取出。然后再通过无限稀释法处理获得单一菌株。

在一个具体的实施方式中，PDA培养基配方为：马铃薯200g/L、葡萄糖或蔗糖10g/L、琼脂18g/L。

在一个具体的实施方式中，LB培养基配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母浸出粉5g/L、NaCl 10g/L，pH＝7；在上述配方中加入琼脂形成LB固体培养基。

与现有技术相比，本发明的分离筛选方法具有以下有益效果：

(1)本发明方法很容易得到新的拮抗细菌菌株，该菌株对橡胶树炭疽菌RC178具有十分明显的拮抗作用；它常用作生防菌，有望制成微生物制剂，为橡胶树炭疽病生物防治提供基础准备。

(2)使用本发明方法得到的拮抗细菌菌株可以大幅度的减少化学农药对环境带来的污染，同时，可以达到控制病害发生的目的。

附图简介

图1显示了拮抗细菌与RC178对峙图。

图2显示了拮抗细菌的菌落形态和孢子形态。

具体实施方式