[发明专利]厌氧氨氧化菌亚硝酸盐还原酶表达载体及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种厌氧氨氧化菌亚硝酸盐还原酶表达载体及其构建方法。

背景技术

随着社会的发展，人民生活水平的提高，人们的饮食结构发生改变，由此产生的生活污水中含氮量增加，形成了低碳氮比污水。传统的硝化/反硝化工艺处理低碳氮比污水时，因碳源不足脱氮效率更低，使出水总氮含量严重超过排放标准。这种污水排放到自然水体后，使水中藻类等浮游生物大量生长繁殖，破坏水体生态平衡。同时，因碳源不足造成在生物脱氮过程中，硝化/反硝化过程不完全，导致亚硝酸盐大量累积。当含大量亚硝酸盐的污水排放到自然水体中时，亚硝酸盐浓度积累到0.1mg/L后，将对水体中鱼、虾、蟹等产生危害。其与血液中的携氧蛋白结合，而使之失去携带氧气的功能，从而表现为缺氧症状。当亚硝酸盐通过水产动物进入食物链被误食后，在胃酸作用下，与蛋白质分解产物二级胺反应生成亚硝胺。此外，胃内的硝酸还原菌，也能使亚硝酸盐与胺类结合成亚硝胺。亚硝胺具有强烈的致癌作用，主要引起食管癌、胃癌、肝癌和大肠癌等，危害人体健康。由亚硝酸盐引起食物中毒的机率较高。摄入0.3-0.5g的亚硝酸盐即可引起中毒甚至死亡。因此，去除低碳氮比污水中的亚硝酸盐迫在眉睫。

厌氧氨氧化(Anammox)工艺，是由荷兰Delft理工大学根据厌氧氨氧化原理研究开发的一种新型污水生物脱氮工艺。其作用机理是，在厌氧或者缺氧条件下，厌氧氨氧化微生物以NO₂^--N为电子受体，将NH₄⁺-N氧化为氮气的生物过程。该工艺核心厌氧氨氧化细菌为自养型，无需外加碳源，只需无机碳源CO₂，避免了低碳氮比污水处理过程中有机碳源不足的缺陷。同时，Jensen M M和Güven D等研究发现，Anammox菌可成功的氧化丙酸，同时葡萄糖、甲酸、丙氨酸不影响Anammox过程。这为Anammox工艺处理低碳氮比污水的可行性提供了理论支持。

在厌氧氨氧化细菌中，各种酶机制的相互作用在整个过程中起关键作用。其中，亚硝酸盐还原酶(nirS)将污水体系中亚硝酸盐还原，是整个厌氧氨氧化反应的关键步骤。因此，近年对Anammox菌中nirS酶的研究日益增多，Meng L等从分子生物学角度出发研究发现，nirS酶可作为检测Anammox菌的新型功能性生物标记物。虽然厌氧氨氧化反应去除亚硝酸盐前景可观，但厌氧氨氧化细菌对生长环境要求苛刻，存活率低，并且不能富集培养纯厌氧氨氧化菌，导致厌氧氨氧化反应的运用停滞不前。基因重组方法可有效解决厌氧氨氧化细菌富集难问题，同时，重组细菌nirS酶基因的高效表达可实现亚硝酸盐的高效去除。解除污水中亚硝酸盐对人体的潜在危害。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种厌氧氨氧化菌亚硝酸盐还原酶表达载体。

本发明的目的之二在于提供该厌氧氨氧化菌亚硝酸盐还原酶表达载体的构建方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种厌氧氨氧化菌亚硝酸盐还原酶表达载体，其特征在于该厌氧氨氧化菌亚硝酸盐还原酶表达载体为SEQ ID NO.1所示的碱基序列。

一种宿主细胞，其特征在于该宿主细胞包含上述的厌氧氨氧化菌亚硝酸盐还原酶表达载体。

一种构建上述的厌氧氨氧化菌亚硝酸盐还原酶表达载体的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a. 厌氧氨氧化菌亚硝酸盐还原酶的DNA作为模板进行PCR扩增，所用的引物为：

正向引物AnnirS379F：5^，-TCTATCGTTGCATCGCATTT-3^，，

反向引物nirS821R：5^，- GGATGGGTCTTGATAAACA-3^，；

b. 将步骤a所得的PCR产物经DNA连接酶4℃过夜连接到pGEM-T载体，得到厌氧氨氧化菌亚硝酸盐还原酶表达载体。

上述的PCR扩增的具体步骤为：

a. 所用的PCR扩增的体系为：每50ml反应体系中含：

b. PCR扩增的反应条件为：

94℃  5min

将本发明的表达载体导入大肠杆菌JM109内得到大肠杆菌DH5α的阳性克隆，通过加入IPTG进行诱导，使该重组菌表达出具有生物学活性的亚硝酸盐还原酶，进而优化发酵条件提高亚硝酸盐还原酶的表达量，最终实现酶制剂法实现低碳氮比废水的应用处理。