[发明专利]一株高产雄甾-4-烯-3,17-二酮的植物甾醇转化菌株的选育

说明书

技术领域

一株高产雄甾-4-烯-3,17-二酮的植物甾醇转化菌株的选育，属于生物工程中发酵技术领域。

背景技术

甾体药物(steroid hormone drugs)是指分子结构中含有甾体结构的药物，其具有很强抗感染、抗过敏、抗病毒及抗休克的药理作用，是临床上一类重要的药物。主要分为两类药物：糖皮质激素和性激素。糖皮质激素用于临床上的药物主要有醋酸可的松、醋酸地塞米松、醋酸氟轻松等。性激素主要有雌性激素、雄性激素、蛋白同化激素及孕激素等。性激素药剂主要包括：黄体酮、苯丙酸诺龙、甲睾酮等。近年来随着人们对生活质量、身体健康需求的日益提高以及当今社会日益加重的老龄化问题，甾体药物体现的价值日益显著。甾体药物被广泛用于抗肿瘤，抗炎，抗痉挛和抗过敏；预防和治疗许多严重性的疾病，例如：激素依赖型的乳腺和前列腺癌、结肠癌、肥胖症、慢性糖尿病、类风湿性关节炎、高血压、哮喘、湿疹、炎症、代谢紊乱、神经性退化老年症、中枢神经系统紊乱症、妇科疾病、过敏性休克、肾上腺激素分泌不全、抑制HIV整合酶、HIV的感染、AIDS等。在最畅销的药物产品中，甾体药物是仅次于抗生素的第二大类药物，甾体药物的年产量超过了100万吨，全球销售总额超过了100亿美元。

在甾体激素的生产过程中AD(androst-4-ene-3,17-dione，雄甾-4-烯-3，17-二酮)和ADD(androsta-1,4-diene-3,17-dione，雄甾-1，4-二烯-3,17-二酮)是重要的中间体，它们可用于合成矿质皮质激素(螺内酯)、氢化可的松、雄激素(睾酮、甲基睾酮)、甲基雄甾烷醇酮、卵泡激素(乙炔雌二醇、乙炔雌二醇甲酯、雌二醇、雌三醇)、黄体激素等十几种甾体药物。

目前雄甾烯酮AD(D)的制备方法主要有以下三种：(一)从动植物的组织液中直接提取，产率很低而且成本较高，不适宜大规模工业化生产；(二)由非甾化合物化学法直接合成，不仅成本高、收率低，而且污染严重；(三)从植物和动物中分离出的类固醇中间体原料合成。

第三种生产方式是目前生产雄甾烯酮的主要方式，这种生产方式使用的原料主要是薯蓣皂素，由于以薯蓣皂素为原料存在成本高昂等诸多缺点，因此各国科学家都在寻找新的廉价原料代替皂素用来生产甾体药物。由于动植物甾醇是从制糖、食用油精炼等行业的废料中提取出来的，具有价格低廉易获得的优点，因此微生物法转化动植物甾醇为雄甾烯酮成为各国科学家新的研究热点。20世纪50年代，美国Upjohn公司首先利用侧链上有双链的大豆甾醇为原料生产出AD和ADD。20世纪70年代初，日本的研究学者有马启利用微生物降解胆固醇成功生产ADD。2002年Dias等将油脂脱臭蒸馏物中富集的植物甾醇混合物用分枝杆菌NRRLB-3805处理得到AD和ADD，且收率相当高。

由于大多数甾醇侧链降解菌无法积累单一产物，而是同时积累三个结构相近且很难进行分离纯化的化合物(AD、ADD与9α-OH-AD)，所以大多数甾醇侧链降解菌无法在工业上应用。本实验室保藏有一株能有效转化植物甾醇为AD和ADD混合物的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloiquefaciens)ST 06，其混合产物中AD:ADD＝2.5：1，混合物中ADD的比例还是比较大，15g/L底物投加量，30℃，160rpm条件下，发酵7d，AD的产量为2.84g/L，ADD的产量为1.18g/L。实验室前期选育获得一株转化植物甾醇为单产雄甾-1，4-二烯-3,17-二酮ADD的菌株，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌(B.amyloiquefaciens)ST 06-95，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 208135。已获得国家发明专利，专利号ZL200810155130.7。

本发明通过常压室温等离子体快速诱变的方法，对原始菌株B.amyloiquefaciens ST 06进行诱变处理，经过一系列的初筛和复筛，从500株变异菌株中选育获得了一株高产AD的菌株，15g/L底物投加量，30℃，160rpm条件下，发酵7天，AD产量为8.41g/L，ADD产量为0.45g/L，AD：ADD＝18:1。对其发酵条件进行了初步研究，为微生物转化甾体药物工业化提供了基础。

发明内容