[发明专利]一株高产雄甾-4-烯-3,17-二酮的植物甾醇转化菌株的选育

权利要求书

1.采用常压室温等离子体(ARTP)诱变技术，得到一株高产雄甾-4-烯-3,17-二酮AD的植物甾醇转化菌株，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌ST 12-96，该菌株相较于出发菌株解淀粉芽孢杆菌ST 06，在底物投加量为15g/L情况下，发酵7d后，AD的产量从2.84g/L提高到了8.41g/L，AD在AD与ADD的产物混合物中的比例由2.5:1提高到了18:1。

2.权利要求1所述菌株ST 12-96是通过如下方法获得的

(1)出发菌株ST 06常压室温等离子体(ARTP)诱变致死率曲线的制定：本研究采用高纯氦气作为等离子体的工作气体，电源功率40W，照射距离2mm，等离子体的温度<40℃，气流量12.5L/min，处理菌液10μl，选择照射时间60s、90s、120s、150s、180s，制定致死率曲线，选择致死率在70～90％的时间作为诱变时间；

(2)出发菌株ST 06经ARTP照射150s，诱变后用无菌生理盐水适当稀释，然后涂布于以甾醇作为唯一碳源的培养基LC1上，30℃培养48h；

(3)从甾醇平板LC1中挑取单菌落克隆菌株500株接种到以雄甾-4-烯-3,17-二酮AD为唯一碳源的培养基LC2固体培养基中，30℃培养48h；选择在LC1上长势良好，LC2上不长或长势缓慢的菌落268株进行摇瓶发酵复筛，挑选转化率及产物中AD所占比例提高的菌株；得到一株高产雄甾-4-烯-3,17-二酮AD的植物甾醇转化菌株；

所述培养基组成：

基本培养基LC(g/L)为：CH₂COONH₄1.5，MgSO4﹒7H₂O 0.2，K₂HPO₄0.4，KH₂PO₄0.8，FeSO₄﹒7H₂O 5×10^-3，ZnSO4﹒7H₂O 2×10^-3，MnCl₂﹒4H₂O 5×10^-4；

培养基LC1：在LC基础上，以甾醇为唯一碳源，含量为15g/L；甾醇成分中豆甾醇﹥96％；

培养基LC2：在LC基础上，以AD为唯一碳源，含量为10g/L。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖20，K₂HPO₄0.2，MnCl₂5×10^-4，植物甾醇15，羟丙基-β-环糊精45，大豆蛋白胨10，初始pH 7.0；

发酵条件：30℃，160rpm发酵7d，接种量10％。

3.用权利要求1所述ST12-96菌株发酵产雄甾-4-烯-3,17-二酮的方法，其特征是ST12-96在固体培养基(g/L)：蛋白胨5，葡萄糖5，牛肉膏3，琼脂20，pH 7.0，培养46～48h，然后转入种子培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏6，NaCl 15，pH 7.0，培养45h，按10％接种量接种于发酵培养基(g/L)：葡萄糖20，K₂HPO₄0.2，MnCl₂5×10^-4，植物甾醇15，羟丙基-β-环糊精45，大豆蛋白胨10，初始pH 7.0，发酵7d。