[发明专利]磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶的制备及其产品和应用

说明书

技术领域

本发明属于纳米材料制备技术和生物催化技术领域，尤其是涉及一种磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶的制备方法及其产品和应用。

背景技术

茶氨酸是一种非蛋白质氨基酸，属酰胺类小分子化合物，仅被发现存在于山茶科植物和一种蕈体内，是具有生物活性的次生代谢产物。研究表明，茶氨酸能够作为一种安全可靠的食品和保健品添加剂用以改善风味，降低血压，帮助缓解焦虑情绪并促进学习和记忆，保护神经系统及抗氧化等作用。

茶氨酸存在L型和D型两种对映体，自然界天然存在的茶氨酸多为L型。高效拆分茶氨酸对映体，是深入探讨L型和D型茶氨酸对人类健康影响的关键。在众多的氨基酸拆分技术中，由于酶法具有拆分效率高、立体选择性高、反应条件温和、专一性强、操作简单和有利于环保等优点，使得它在工业生产中具有很好的应用前景。氨基酰化酶法是同时得到两种构型氨基酸的最佳拆分方法，在日本已实现工业化生产。

氨基酰化酶(EC 3.5.1.14；aminoacylase)，也称N-酰基-L-氨基酸酰胺水解酶(N-acyl-L-amino-acid aminohydrolase)，它是生物技术领域应用最广泛的十种酶之一。该酶具有较强光学特异性，它将L-氨基酸酰化物水解成L-氨基酸，而未被水解的D-氨基酸酰化物和L-氨基酸分离后，经过一步水解就可以得到D-氨基酸，从而将L-氨基酸和D-氨基酸分离开来。由于使用游离酶拆分氨基酸时，酶的利用率低，生产成本较高，也不利于产品的分离纯化。因此，通过固定化酶拆分氨基酸是工业应用的趋势。

纳米磁性材料因具有超顺磁性、量子尺寸效应，表观磁性等一系列特殊性质，近年来成为研究热点。根据不同需要，纳米颗粒表面经过修饰后可以带上-NH₂、-COOH、-CHO等活性基团，这些基团又可以再连接抗体、生物酶、蛋白等具有生物活性的大分子物质。在生物医学方面，纳米磁性材料可用于靶向药物、核磁共振成像、磁热疗等，具有广阔的应用前景。

在众多磁性纳米材料中，Fe₃O₄磁性纳米颗粒备受关注，它是反尖晶石结构铁氧体，具有制备工艺简单、无毒、性质稳定、生物相容性好等优点。磁性四氧化三铁纳米颗粒具有良好的表面活性和吸附性能，更具有超顺磁性，方便固定化酶在外加磁场的作用下快速回收，避免离心、筛板等耗能步骤。制备Fe₃O₄磁性纳米颗粒的常用方法有共沉淀法、溶胶凝胶法、微乳液法、水热法(溶剂热法)、模板合成法。

中国专利CN 101671664 A公布了一种固定化氨基酰化酶的制备方法，其包含下列步骤：在水中，60-90℃下将固定化材料(卡拉胶和明胶)溶解，降温至40-60℃，再加入氨基酰化酶，混合均匀，然后将此混合液流加到温度为20-35℃的有机溶剂中，搅拌，过滤得颗粒，将所得颗粒加入到KCL水溶液中固化，即可制得固定化氨基酰化酶，其中，所述的KCL水溶液中还含有戊二醛。该专利还公开了由其制得的固定化氨基酰化酶及其应用。其制备方法可有效降低固定化材料的凝固点，并且制得的固定化氨基酰化酶是颗粒状，流动性好，可以高效方便的拆分光学活性氨基酸。上述专利专注于酶的固定化，产品为固体颗粒，且需要过滤回收的固体颗粒，步骤繁琐。上述专利的产物的最适反应温度为37℃。但是在工业发酵生产过程中，发酵罐内温度很难达到37℃这样的低温，或者需要价格高昂的冷却设备才能达到，所以，上述专利的实用性较差。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶的制备方法及其产品和应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明第一方面提供一种磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备四氧化三铁纳米颗粒；

(2)将四氧化三铁纳米颗粒超声分散后，在氮气保护下，与3-氨丙基三乙氧基硅烷反应，制备氨基修饰的四氧化三铁纳米颗粒；

(3)将氨基修饰的四氧化三铁纳米颗粒与氨基酰化酶溶液混合反应，得到磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶。

步骤(1)中制备四氧化三铁纳米颗粒的方法通过化学共沉淀法完成，优选以下条件能够制备出磁性强、性质稳定的磁性四氧化三铁纳米颗粒：