[发明专利]一种鸭肝炎病毒免疫原及高免血清的制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于动物免疫学领域，尤其涉及一种鸭肝炎病毒免疫原及高免血清的制备方法与应用。

背景技术

鸭病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis，DVH)是由鸭肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus，DHV)引起的一种高度致死性传染病，以发病急、病程短、发病率和死亡率高为特点。鸭病毒性肝炎分为3个各自独立的没有血清学关系的血清型：I型、II型和III型。其中，血清I型鸭肝炎病毒(DHV-I)又称鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus，DHAV)，是目前我国流行的主要鸭肝炎病毒，给我国养鸭业造成了巨大的经济损失，威胁着养鸭业的健康发展。

鸭甲型肝炎病毒目前发现有三种基因型，即DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3，根据报道，我国目前流行的主要是DHAV-1，三种基因型均属于小RNA病毒科禽肝病毒属，病毒粒子呈球形或类球形，核衣壳呈20面体对称，直径为20～40nm，无囊膜，胞浆内繁殖，核酸为不分节段的单股正链RNA。该病毒对乙醚、氯仿、甲醇、胰酶、硫酸铵、常用消毒剂等有一定程度的抵抗力；能耐受pH3.0的酸性环境；对热也有较强抵抗力，56℃加热1小时仍有部分病毒存活。鸭甲型肝炎病毒不能凝集任何动物的红细胞，可在鸭胚和鸡胚的绒毛尿囊腔及鸡胚组织、鸭胚肝细胞、鸭胚肾细胞、鹅胚肾细胞等中增殖。

在免疫学相关的实验研究和生产实践中，常常涉及到免疫原的制备。其中由于病毒必须在活的宿主细胞中才能增殖，因此获得的病毒材料实际上是病毒与增殖该病毒的宿主成分的一个混合物。当然，在以病毒作为免疫原的用途中，有的可以直接使用该病毒与宿主成分的混合物作为免疫原，如制备灭活苗或弱毒苗的免疫原，但在有的方面，需要尽可能去除宿主成分，如病毒单克隆抗体 制备中的免疫原，如尽可能去除宿主成分，将在单克隆抗体的筛选中可减少假阳性的非目标杂交瘤细胞；又如在制备诊断检测用途的病毒多克隆抗体时，需要尽可能去除宿主成分以保证获得的多克隆抗体的特异性，但由于病毒的培养增殖、形态大小、结构组成等方面的特殊性，不可能像纯化细菌那样方便、快速地获得纯的免疫原，目前为止，还没有一个通用、简便的获得较纯净的病毒免疫原的方法；正是由于获得较纯的病毒免疫原的困难，同时也导致获得高特异性的高免血清的困难。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鸭肝炎病毒免疫原及高免血清的制备方法与应用，旨在解决由于获得较纯的病毒免疫原的困难，同时也导致获得高特异性的高免血清的困难的问题。

本发明是这样实现的，一种鸭肝炎病毒免疫原的制备方法，包括以下步骤：

(1)将鸭肝炎病毒在9～10日龄鸡胚或10～12日龄鸭胚尿囊腔接种进行增殖，收集36～60h内死亡并且胚体有明显病变的尿囊液，将尿囊液反复冻融3次，5000r/m离心30min，取上清；

(2)将步骤(1)得到的上清与等量氯仿相混合，4℃作用1h后，5000r/m离心30min，取上清，如此重复两次；

(3)将步骤(2)中经氯仿离心处理后的上清在40000r/m下离心2h，用PBS溶解沉淀得到鸭肝炎病毒免疫原。

优选地，在步骤(1)中，所述鸭肝炎病毒为血清1型鸭肝炎病毒CH60株或血清3型鸭肝炎病毒CH-1株。

优选地，在步骤(3)中，所述PBS的用量为：20ml尿囊液对应使用0.5ml PBS，鸭肝炎病毒免疫原含量为1500μg/ml。

本发明进一步提供了一种鸭肝炎病毒高免血清的制备方法，以上述鸭肝炎 病毒免疫原为抗原，包括以下步骤：

(1)将弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂在研钵中研磨均匀，然后边磨边加入抗原，研磨充分后得到免疫注射液；

(2)用弗氏完全佐剂与抗原制备而成的免疫注射液1ml在免疫动物背部皮下多点注射进行第一次免疫；其中，免疫注射液的抗原终浓度为500μg/ml；

间隔7～10d后，用弗氏不完全佐剂与抗原制备而成的免疫注射液2ml进行第二次免疫，免疫途经和部位与第一次免疫相同；其中，免疫注射液的抗原终浓度为500μg/ml；

(3)间隔7～10d后，进行第三次免疫，免疫注射液、免疫剂量和注射方法与第二次免疫相同；

(4)间隔7～10d后用生理盐水稀释鸭肝炎病毒免疫原至其抗原浓度为500μg/ml，采用耳缘静脉缓慢注射方式进行第四次免疫，免疫剂量为1ml；

(5)7d以后，用琼脂扩散法测定血清效价，当免疫动物的琼扩效价达到1:32及以上时，颈动脉无菌采血分离血清，-20℃保存，即为粗制鸭肝炎病毒高免血清。