[发明专利]猪伪狂犬病毒毒株及由其制备的灭活疫苗和应用

说明书

技术领域

本发明涉及猪伪狂犬病毒毒株，尤其涉及一株性能优异的猪伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus)强毒株，本发明还涉及由所述猪伪狂犬病毒强毒株制备的灭活疫苗及其应用，属于猪伪狂犬病毒毒株的分离和应用领域。

背景技术

猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病毒引起的，往往以爆发流行的方式流行。初生仔猪感染本病毒后死亡率极高，成年猪感染该病毒多呈隐性状态，死亡率较低，但怀孕母猪容易发生流产、弱胎、死和木乃伊胎。健康猪与带毒猪、病猪直接接触可感染本病毒。该病毒的免疫抑制作用可增强受感染成年猪对其他病原的易感性，结果导致受病毒感染猪死亡率增加。近年来，猪伪狂犬发病的季节性不明显，发病率上升，除猪蓝耳病以外，猪伪狂犬病已成为危害母猪繁殖功能的第二大疾病。

预防该病最行之有效的办法是接种疫苗。目前，市售的猪伪狂犬病疫苗绝大多数为猪伪狂犬病的常规弱毒疫苗和灭活疫苗。由于流行毒株不断发生变异，与市售疫苗在免疫原性方面存在差异，导致传统毒株制备的疫苗不能很好的防控当今流行的猪伪狂犬病。因此，亟待开发新的免疫原性好的猪伪狂犬病疫苗，实现对目前流行的猪伪狂犬病的有效防治。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一株分离的猪伪狂犬病毒毒株，采用该毒株制备的灭活疫苗免疫原性好，能够有效防治目前流行的猪伪狂犬病。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先公开了一株分离的猪伪狂犬病毒PRV-JL株。

本发明将分离的猪伪狂犬病毒PRV-JL株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.9903；分类命名是：猪伪狂犬病毒；保藏时间是：2014年10月28日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明从吉林某发病猪群母猪死胎的脑组织、扁桃体等组织中分离出一株猪伪狂犬病毒PRV-JL株。将分离的猪伪狂犬病毒PRV-JL株空斑纯化后，测定猪伪狂犬病毒PRV-JL株的病毒含量为10^7.96TCID₅₀/0.1mL。采用PCR方法扩增PRV-JL株的gE基因，结果扩增出一条1740bp的条带，完全符合gE基因的大小。免疫荧光法检测结果表明，分离病毒PRV-JL株感染的盖玻片培养物，在细胞质中存在许多绿色的荧光灶，而未接种分离病毒的阴性对照盖玻片培养物没有特异性荧光出现。病毒PRV-JL株gE基因的进化树分析结果可见，基因进化树分析图中，新分离毒株PRV-JL株位于一个相对独立的分支中。gE基因推导的氨基酸序列比对发现，新分离株PRV-JL株与大多数毒株相比，在54位、448位和512位发生了54位(G-D)、448位(V-I)和512位(G-S)突变，在第48位插入一个D，同时第492-495位的4个D之间也插入一个D，变成了5个连续的D。本发明分离的PRV-JL株是一株猪伪狂犬病毒变异株强毒。

本发明猪伪狂犬病毒PRV-JL株能够应用于制备预防猪伪狂犬病的疫苗或药物。

本发明进一步公开了一种预防猪伪狂犬病的疫苗组合物，包括：免疫上有效量的猪伪狂犬病毒PRV-JL株和药学上可接受的佐剂。

本发明还公开了一种猪伪狂犬病灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：(1)扩增所述的猪伪狂犬病毒PRV-JL株，收获病毒液；(2)加入灭活剂灭活病毒液，浓缩；(3)制备水相和油相；(4)将水相和油相混合，乳化，即得。

其中，步骤(1)所述扩增为采用Vero细胞培养猪伪狂犬病毒PRV-JL株；优选的，将分离的猪伪狂犬病毒PRV-JL株按病毒维持液量的1％接入形成单层的Vero细胞培养物中；所述培养条件优选为37℃旋转培养。

步骤(2)按照质量g/体积mL计，灭活剂与病毒液的比例为0.02：100；所述灭活剂为二乙烯亚胺溶液；优选的，按照质量g/体积mL计，所述二乙烯亚胺溶液的浓度为2％。所述灭活为在30℃灭活60h；优选的，在30℃、100r/min摇床上灭活60h，然后加入2％硫代硫酸钠溶液，终止灭活。

步骤(2)所述浓缩优选为浓缩5倍。

步骤(3)所述制备水相包括：将吐温-80与浓缩后的灭活病毒液按照体积比4：96混合均匀，得到水相；

所述制备油相包括：将白油、司本-80、硬脂酸铝按照体积比94：6：1.5混合均匀。

步骤(4)将水相和油相按照体积比1：1.5混合均匀。