[发明专利]醛酮还原酶及其在合成(2S,3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯中的应用

说明书

本发明提供了一种新的醛酮还原酶突变体及利用重组醛酮还原酶突变体或其冻干粉进行不对称还原的方法。在催化浓度高达1000g/L的底物时，产物的光学纯度仍高达98％以上，且不需要额外添加昂贵的辅酶。相对于其它不对称还原制备方法，使用本发明方法制备所得的产物浓度高，并且具有产物光学纯度高、反应条件温和、对环境友好、操作简便、易于工业放大的优点，因此具有很好的工业应用前景。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种醛酮还原酶突变体，生产该醛酮还原酶突变体的基因工程菌的构建，及该醛酮还原酶突变体的生产方法及其在生物催化制备(2S,3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯中的应用。

背景技术

属于酮还原酶(KRED)或羰基还原酶类的酶对于从相应的前体立体异构酮底物或相应的外消旋醛底物中合成旋光的醇有用。典型的，KRED将酮和醛底物转化为相应的醇产物，但是也可催化逆反应，将醇底物氧化为相应的酮/醛产物。用如KRED的酶对酮和醛的还原以及醇的氧化需要辅因子，最常见的为还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，以及用于氧化反应的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)。NADH和NADPH作为电子供体，而NAD和NADP作为电子受体。经常观察到酮还原酶和醇脱氢酶接受磷酸化的或非磷酸化的辅因子(以其氧化的或还原的状态)。

KRED酶可在广泛范围内的细菌和酵母中发现(综述参见：Kraus和Waldman，Enzymecatalysis in organic synthesis(有机合成中的酶催化)第1&2卷；VCH Weinheim 1995；Faber,K.,Biotransformations in organicchemistry(有机化学中的生物转化)，第4版，Springs,Berlin HeidelbergNew York.2000；Hunnel和KuIa,1989,Eur.J.Biochem.184:1-13)。已经报道了一些KRED基因和酶序列，例如，木兰假丝酵母、近平滑假丝酵母、赭色掷孢酵母。

4-乙酰氧基氮杂环丁酮(简称4AA)是一种重要的手性合成子，是合成碳青霉烯和青霉烯类新型广谱抗生素的重要中间体，如用于合成亚胺培南、法罗培南、美罗培南等。

4AA的化学结构式如式I所示。4AA的分子骨架特征是一个四元内酰胺环， 共含有3个手性中心，存在8种立体异构体，如何高选择性地建立手性中心，是合成4AA的关键所在。日本NOyori和Takasago公司采用以乙酰乙酸乙酯为起始原料的路线，各步的收率和立体选择性都很好，总收率高达50％，是一条非常具有工业化前景的路线，该工艺路线如式1所示，其中R是含有1～6个碳原子的饱和低级烷基。在该路线中，乙酰乙酸乙酯首先与卤化后N-羟甲基苯甲酰胺反应，生成2-苯甲酰氨甲基-3-羰基丁酸酯(式II)，然后利用手性催化剂(R)-BINAP-Ru经过羰基不对称还原反应，生成(2S,3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯(式III)，再经过脱保护基、分子内成酰胺键、叔丁基二甲硅基保护、三氯化钌催化下的乙酰氧基化得到4AA。

在上述路线中，最关键的步骤是手性催化剂(R)-BINAP-Ru不对称催化2-苯甲酰氨甲基-3-羰基丁酸酯(式II)生成(2S,3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯(式III)，但由于该过程需要使用到贵重金属钌作为催化剂，并且需要在高温高压条件下进行，对反应器要求较高，因此造成该路线生产成本较高，限制了4AA大规模工业化生产。

近年来，利用生物催化进行不对称反应的方法以其高度的化学、区域和立体选择性，受到了越来越广泛的关注。采用的生物催化剂既可以是提纯的酶，也可以是微生物细胞。由于生物催化还原反应需要价格昂贵的辅酶参与，因此，通常采用具备辅酶再生系统的微生物全细胞作为催化剂。