[发明专利]一种原位形成拉曼增强基底检测水中大肠杆菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种原位形成拉曼增强基底检测水中大肠杆菌的方法。

背景技术：

全世界每天有11亿人等待安全用水，在发展中国家因饮用水大肠杆菌污染，导致数以万计的人患病。十一五期间，我国突发环境事件中，7成涉及饮用水安全，其中不乏因大肠杆菌污染水体，影响饮用水安全，危害人体健康，阻碍经济、社会的可持续发展。严峻的现实迫使研究者必须开发高效、快速、特异性检测水中大肠杆菌的新方法和新技术，为保障人们用水安全，保护人体健康提供技术支持。

目前，对水环境中大肠杆菌的检测方法主要包括常规培养检测，分子生物学检测、免疫检测等。这些方法虽各具优势，但也存在一些不足。常规培养检测技术要求简单，但首先需要对水体中致病菌进行培养，这个过程至少需要48-72h才能完成，检测耗时、费力。分子生物学检测常通过提取大肠杆菌DNA或者RNA，使用PCR技术对提取的核酸进行特异性扩增，然后通过检测核酸实现对大肠杆菌的检测，该方法检测灵敏度高，特异性强，但无法实现现场分析检测，不能够实时评估水环境污染状况。免疫检测大肠杆菌虽然检测特异性强，但检测灵敏度较低。因此，开发简单、易操作、特异性的检测水中大肠杆菌的方法，对评估水环境污染程度，保障用水安全，促进经济发展起着非常重要的作用。

发明内容：

本发明的目的是克服现有技术中方法的不足，提供一种原位形成拉曼增强基底的方法，利用氧化石墨烯和银纳米颗粒共同表面拉曼增强效应，实现对水中大肠杆菌的信号放大检测。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案：一种原位形成拉曼增强基底的方法，包括以下步骤：

（1）选择检测大肠杆菌：使用LB培养基培养大肠杆菌，37℃条件下培养过夜，取细菌培养液，4000rpm/min离心5min，去除培养基，然后使用pH7.4 PBS缓冲液重悬菌体，稀释菌体，等待检测；

（2）原位形成拉曼增强基底：修饰有1μg/mL-10μg/mL葡萄糖氧化酶和0.1μg/mL-20μg/mL抗大肠杆菌抗体的0.1μg/mL-1μg/mL氧化石墨烯与大肠杆菌结合，2000rpm/min-3000rpm/min离心5min，收集菌体，pH7.4 PBS缓冲液重悬；加入0.5μg/mL-50μg/mL银纳米种子，氧化石墨烯表面的葡萄糖氧化酶催化1μg/mL-50μg/mL葡萄糖，生成过氧化氢；过氧化氢与10μg/mL-50μg/mL银离子反应，促进银纳米种子生长，形成银纳米颗粒，并吸附到氧化石墨烯表面，原位形成拉曼增强基底；2000rpm/min-3000rpm/min离心5min，收集菌体，pH7.4 PBS缓冲液重悬。

（3）加入10μg/mL-20μg/mL拉曼报告分子，反应10min， 2000rpm/min-3000rpm/min离心5min，收集菌体，使用pH7.4 PBS缓冲液清洗菌体，2000rpm/min-3000rpm/min离心5min收集菌体，使用激光拉曼仪检测拉曼报告分子的拉曼增强信号，拉曼信号强度与大肠杆菌浓度成正相关性，以此实现对水中大肠杆菌的信号放大检测。

本发明利用氧化石墨烯表面的抗大肠杆菌抗体捕捉大肠杆菌，利用氧化石墨烯表面的葡萄糖氧化酶催化葡萄糖生成过氧化氢促进银纳米种子生长，形成银纳米颗粒，吸附到氧化石墨烯表面，原位形成拉曼增强基底，利用氧化石墨烯和银纳米颗粒共同表面拉曼增强效应，实现对水中大肠杆菌的信号放大检测。该方法检测灵敏度高，特异性强，可以进行现场分析检测，实时评估水环境污染状况，对评估水环境污染程度，保障用水安全，促进经济发展起着非常重要的作用。

以下结合实施例和附图进一步说明本发明，而非限制本发明。

附图说明

图1为原位形成拉曼增强基底检测水中大肠杆菌原理图；

图2为检测不同浓度大肠杆菌拉曼信号相对强度；

图3为检测相同浓度大肠杆菌和金黄色葡萄球菌拉曼信号相对强度。

具体实施案例：

实施例1

1、大肠杆菌选择：

选取大肠杆菌O157:H7作为实施例检测目标菌。使用LB培养基培养大肠杆菌O157:H7，37℃条件下培养过夜。取1mL细菌培养液，4000rpm/min离心5min，去除培养基，然后使用pH7.4 PBS缓冲液重悬菌体，稀释菌体，最终菌体浓度为10⁴cfu/mL、10⁵cfu/mL、10⁶cfu/mL、10⁷cfu/mL以方便检测。