[发明专利]转基因苜蓿草J163品系特异性定性PCR检测用引物及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种转基因苜蓿草J163品系特异性的定性PCR检测用引物及检测方法。

背景技术

转基因苜蓿草J163品系由孟山都公司开发的耐除草剂的转基因品系，2005年美国和加拿大批准环境释放和作为饲料应用，目前我国尚批准其进口。还未获得我国转基因生物安全证书。转基因苜蓿通过饲料进入动物养殖的食物链，致使牛奶、肉等制品成为转基因食品，可能对于人的健康产生影响。根据《农业转基因生物标识管理办法》，凡是在中国境内销售的转基因生物，必须进行标识。为保障消费者的知情权，转基因产品标识制度在30多个国家和地区应用。中国目前实施无阀值的强制性标识制度。

对转基因产品标识需要检测方法的支撑。目前对转基因产品的检测主要包括对蛋白质和核酸检测两大类，后者均以PCR为基础的检测技术，PCR技术具高的灵敏度、特异性和稳定性，检测周期短，成本较低。能过普通凝胶电泳观察条带的有无判定扩增产物的有无，通过电泳条带的浓度可以分析检测方法的灵敏度。一方面普通定性PCR通过后续电泳条带的有无进行定性判定目的基因的有无，可适合转基因定性检测的需求，另一方对普通定性PCR对操作者技术水平要求较低，仅需价格低廉的简单PCR仪即可进行，适用于基层实验推广应用。

品系特异性检测方法是基于外源插入片段和宿主基因接合区的边界序列建立特异性的检测方法。品系性特异性PCR检测方法可以对转基因产品品系进行判定，被认为是最适合转基因标识的检测判定方法。目前未见针对转基因苜蓿草J101品系特异性定性PCR检测的相关技术报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有转基因苜蓿草尚无品系特异性检测方法、不能准确地对转基因苜蓿草的品系进行识别、无法对转基因产品进行标识的技术不足，提供一种转基因苜蓿草J163品系特异性定性PCR检测用引物，其具有较高特异性和灵敏度及良好的稳定性，基于所述引物，可成功建立转基因苜蓿草J163品系特异性定性PCR检测方法，实现对转基因苜蓿草J163品系进行定性检测。

本发明要解决的另一技术问题是提供所述引物的应用。

本发明要解决的还一技术问题是提供转基因苜蓿草J163品系进行定性检测的方法。

本发明的上述目的通过以下技术方案予以实现：

本发明通过创造性地分析和大量实验研究总结，在转基因苜蓿草J163品系的5’端外源插入片段P-eFMV与苜蓿草基因组DNA之间的邻接区序列，结合序列生物学信息的分析，设计得到一对特异性的引物。并确定了精确地检测条件，建立特异性强、灵敏度高、稳定性良好的转基因苜蓿草J163品系定性PCR检测方法。

具体地，本发明首次提供了一种转基因苜蓿草J163品系特异性定性PCR检测用引物J163-1和J163-2，其序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示：

SEQ ID NO.1：J163-1：5’- GGACAAGGTCATCCAAACTGA -3’，

SEQ ID NO.2：J163-2： 5’-TGCATGTGCTGGAACAGTAG -3’。

    同时提供一种转基因苜蓿草J163品系特异性定性PCR检测方法，包括以下步骤：

S1.提取DNA作为反应的模板；

S2.采用引物J163-1和J163-2进行定性PCR检测；

其中，S2所述定性PCR检测的反应体系为25μL：Takara Ex Taq12.5μL，引物J163-1和J163-2各为1μL，DNA模板1μL，ddH₂O 10.5μL。

S2所述定性PCR检测的反应程序为：98℃10s，61℃30s，72℃30s，30个循环；扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分析。

本发明采用以下方法验证本发明方法的特异性、灵敏度等：

采用引物J163-1和J163-2对J163及其他11种农作物进行定性PCR检测，测试检测体系特异性。

采用引物J163-1和J163-2对不同浓度的J163基因组DNA进行定性PCR检测，测试检测体系灵敏度。

上述定性PCR检测的反应体系为25μL：Takara Ex Taq12.5μL，引物J163-1和J163-2引物分别为1μL，DNA模板1μL，ddH₂O 10.5μL。

上述定性PCR检测的反应程序为：98℃10s,61℃30s,72℃30s,30个循环。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分析。