[发明专利]一种生产乙醇酸基聚合物的重组菌及其应用

说明书

本发明提供了一种生产乙醇酸基聚合物的重组菌及其应用。该重组菌是将PHB生物合成操纵子phbCAB、聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白基因phaP、辅酶A转移酶基因pct、异柠檬酸裂解酶基因aceA、异柠檬酸脱氢酶激酶基因aceK和乙醛酸还原酶基因ghrA导入宿主大肠杆菌得到的；所述大肠杆菌为E.coli JM109或E.coli JM109ldhA。本发明可以合成两种类型的乙醇酸基聚合物——乙醇酸、乳酸和3‑羟基丁酸共聚酯，乙醇酸和3‑羟基丁酸共聚酯，并且重组菌在摇瓶培养中的生物量和聚合物的产量也能达到较高的水平，具有较好的工业化应用前景。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种生产乙醇酸基聚合物的重组菌及其应用。

背景技术

乙醇酸(glycolic acid,hydroxyacetic acid)别名羟基乙酸或α-羟基乙酸，是最简单的羟基羧酸。作为重要的化工产品和有机合成中间体，乙醇酸在化工、医药、纺织、冶金等多个领域有广泛应用。例如，2％乙醇酸和1％甲酸的混合酸是一种高效低成本的清洗剂，可用于锅炉、管道、冷凝器和热交换器等的清洗；乙醇酸分子小，能有效渗透毛孔，解决皮肤老化、皱纹、暗疮等问题，常用作化妆品添加剂；纺织行业中常用乙醇酸作为染整羊毛纤维及纤维素织品的交联耦合剂；另外，乙醇酸还可用作杀菌剂、粘接剂、石油破乳剂、焊接剂以及化学助剂等。2011年，乙醇酸市场为9330万美元，预计未来几年将以每年超过10％的速度增长，2018年乙醇酸市场可能超过2亿美元。

乙醇酸基聚合物(glycolate based polymers)是一种具有良好生物相容性和生物可降解性的高分子材料，由乙醇酸和其它羟基羧酸单体聚合而成。乙醇酸基聚合物可以替代传统的石油来源塑料用作普通包装材料，也可以用于附加值较高的生物医学领域，比如制备手术缝合线、药物控释载体、骨折固定材料、组织工程支架以及缝合补强材料等。乳酸和乙醇酸的共聚酯(poly lactate-co-glycolate)，简称PLGA或PGLA，是研究较多的乙醇酸基聚合物，常用于制备微囊等控释制剂，作为多种药物、蛋白以及其它大分子的控释载体。PLGA已由美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于医疗器械领域，目前已有多个产品上市，例如世界卫生组织(WHO)批准的首个一次性注射疫苗微球、全球首个多肽控释微球注射剂等，日本、法国和我国等也先后批准在医药领域使用PLGA。

乙醇酸基聚合物在工业上主要通过化学合成的方法制备。例如，以较纯的乙交酯为前体，通过开环聚合可以获得聚乙醇酸；以乙交酯和丙交酯为前体，通过开环聚合可以获得乙醇酸乳酸共聚酯等。化学聚合过程中往往需要重金属离子作为催化剂，目前广泛使用的锡盐类催化剂具有细胞毒性，出于人体安全性的考虑，限制了化学法合成的乙醇酸基聚合物在医药和食品等领域的应用。2011年，Matsumoto等利用大肠杆菌脂肪酸氧化的强化突变株LS5218首次实现了含有乙醇酸单体的聚合物的生物合成。这也是目前为止利用微生物发酵获得乙醇酸基聚合物的唯一报道。过表达来源于假单胞菌Pseudomonas sp.61-3的PHA聚合酶PhaC1STQK和来源于埃氏巨球型菌Megasphaera elsdenii的辅酶A转移酶Pct，以十二酸和乙醇酸为底物，细菌合成的聚合物中含有单体含量为17％的乙醇酸组分，其它羟基脂肪酸单体3-羟基丁酸(3-HB)、3-羟基己酸(3-HHx)、3-羟基辛酸(3-HO)、3-羟基癸酸(3-HD)和3-羟基十二酸(3-HDD)的含量分别为19％、22％、26％、8％和8％。由于大肠杆菌对脂肪酸和乙醇酸利用效果较差，导致细胞干重仅为0.64g/L，聚合物含量也处于较低水平，仅占细胞干重的4.8％。由于生物量和聚合物含量都较低，导致聚合物的提取非常困难，也无法对其材料学性能进行研究。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种重组菌。

本发明所提供的重组菌是将聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白基因phaP、PHB生物合成操纵子phbCAB、辅酶A转移酶基因pct、异柠檬酸裂解酶基因aceA、异柠檬酸脱氢酶激酶基因aceK和乙醛酸还原酶基因ghrA导入宿主大肠杆菌得到的。