[发明专利]一种生物相容性量子点的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于细胞标记技术领域，具体涉及一种生物相容性量子点的制备方法及其应用。

背景技术

在细胞生物学的研究中，为对感兴趣的结构和分子进行观察，最常用的方法是对其进行荧光标记。然而，传统的荧光探针在生物标记领域受到诸多限制。量子点因其特殊的光物理学特性被日益广泛地作为荧光探针，在生物标记领域发挥着越来越重要的作用。

量子点是一种具有纳米尺寸的半导体晶体。与传统的荧光染料相比，量子点拥有许多独特的光学特性，如宽的吸收谱、窄而对称的发射谱、耐漂白、亮度高和荧光寿命长等。由于其出色的光物理特性和相对较小的尺寸，量子点可作为生物学研究的荧光探针。随着量子点合成与修饰技术的发展，其在生物和医学领域的应用已从探索阶段逐步发展到了应用阶段。

因此对目前的量子点制备方法进行改进，提高生物相容性是目前分析检测领域迫切的需求。

目前常用的量子点制备方法有：硅烷化法、量子点表面吸附配体法和包覆法。硅烷化法能有效地将量子点(QuantumDots，QDs)转换为水溶性，但每次只能得到微克量级，并且易出现絮凝、荧光量子产率下降等问题。QDs表面吸附双功能基团配体法能够获得克级的QDs，但是由于巯基乙基配体不稳定，容易从QDs表面脱落，导致QDs团聚和沉淀。包裹法获得的表面修饰QDs稳定性高，不易发生絮凝；但该方法存在技术过程非常复杂、包覆试剂价格昂贵且包裹后QDs尺寸增大等问题。除了上述三种方法之外，还有不少QDs修饰手段，但效果都不够理想，尚不能满足应用所需的全部要求，值得进一步研究。

本申请解决了过去制备方法中粒径不均、毒性大、荧光易淬灭等缺点，提供一种优良的细胞标记材料，可以对活细胞进行荧光标记并进行体内示踪。

发明内容

本发明的目的是克服目前的QDs水溶性差、细胞毒性强等问题，提供一种生物相容性QDs的制备方法，本发明的另一目的是提供上述方法制备的生物相容性QDs在细胞标记技术中的应用。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：本发明首先采用水相法合成硒化镉(CdSe)，通过在CdSe表面生长硫化锌(ZnS)，制备出细胞毒性小的CdSe/ZnS核壳型QDs。合成两性聚合物，然后将两性聚合物与CdSe/ZnS偶联，得到水溶性强、生物相容性好的CdSe/ZnS-Polymer。

由于偶联两性聚合物后的QDs具有水溶性强、生物相容性好，使用其对活细胞进行荧光标记并进行体内示踪成为可能。使用该生物相容性QDs进行干细胞标记，对QDs在体内的分布进行荧光成像，增强了荧光信号，提高了观察灵敏度。

本发明的第一方面，是合成一种生物相容性CdSe/ZnS-Polymer，该方法包括以下步骤：

A、合成CdSe：氮气保护下，39.5mg-158mg硒(Se)粉，优选79mg，溶解于50mL液体石蜡中，温度逐渐增加到200℃。剧烈搅拌1小时后，Se混合物冷却致约100℃。将0.32g-1.28gCdO(优选0.64g)和2.85g-11.4g(优选5.7g)硬脂酸溶解在5ml液体石蜡中，氮气保护下160℃搅拌，得到硬脂酸混合物。当硬脂酸混合物变成亮黄色时，迅速注入Se混合物并迅速增加混合物温度至200℃。90分钟后，反应物的温度降低到60℃，添加50mL氯仿至彻底混合。然后将反应物离心8000转/分钟10分钟，弃上清液。添加50mL的乙醇混合均匀。再次离心后，乙醇再次洗涤沉淀。沉淀物烘干后储存于黑暗环境中，得到CdSe。

B、合成CdSe/ZnS:在50毫升离心管，2g步骤A得到的CdSe分散在20毫升氯仿中超声1小时。溶液被注入到反应瓶中，保持温度135℃3小时，以完全蒸发氯仿。在另外一个小瓶中，45μl-180μl(优选90ul)二乙基锌(diethylzinc，ZnEt₂)和41μl-164μl(优选82ul)六甲基二硅硫烷(hexamethyldisilathiane，(TMS)₂)添加到2.5mL三正辛基氧化磷(Trioctylphosphineoxide，TOPO)中混合均匀。温度达到180℃后，将其慢慢注入反应瓶。添加完成后，溶液温度降低到90℃继续搅拌数小时。加入5mL氯仿防止TOPO固化。冷却到室温。反应混合物在10mL氯仿中重新溶解，转移到50mL离心管。加入同等体积的乙醇5000rpm/min×10min离心两次。烘干并定量。大约加入10ml去离子水防止氯仿蒸发，得到CdSe/ZnS。